ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки. читайте в медицинском журнале клиники Адмиралтейские Верфи. В плане обнаружения ДНК наибольшее распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В Роспотребнадзоре разъяснили, чем отличается тестирование на коронавирус методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) от экспресс-теста.
ПЦР анализ: что это такое?
По сравнению с другими имеющимися методами выделения вирусов ОТ-ПЦР в реальном времени значительно быстрее и имеет меньшую вероятность контаминации образца или ошибок, поскольку все исследование может быть выполнено в одной закрытой пробирке. В качестве материала для исследований методом полимеразной цепной реакции выступают кровь, моча, слюна, мокрота, ликвор, биоптаты тканей, соскобы со слизистых оболочек. Анализ методом ПЦР – это диагностический метод, позволяющий выявить наличие возбудителя заболевания в организме даже, если он присутствует в минимальных количествах. ПЦР анализ на инфекции Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии. один из наиболее чувствительных и надежных количественных методов анализа экспрессии генов. Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач.
Что такое анализ ПЦР?
Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. О сервисе Прессе Авторские права Связаться с нами Авторам Рекламодателям Разработчикам. Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – молекулярно-биологический метод исследования, который позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой фрагмент ДНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала.
Достоверность метода ПЦР
Определить ВИЧ инфекцию можно несколькими способами. Но полимеразная цепная реакция дает однозначный ответ, практически сразу. Потому именно ПЦР считается предпочтительным вариантом и основной мерой диагностики. Венерические инфекции. Обследование проводится в любой момент. В качестве биоматериала забирают мазок со слизистых оболочек уретры.
Методика предоставляет точные результаты. С ее же помощью можно обнаружить ход течения заболевания, давность, наличие иммунитета, сопротивляемость организма. Проводится параллельно с микробиологическим исследованием или вместо него. Зависит от ситуации. На венерические инфекции указывают такие симптомы: боли в области половых органов, рези при мочеиспускании, жжение, зуд, выделения гнойного, прозрачного характера с неприятным запахом или без такового, нарушения отхождения урины.
Герпесвирусные инфекции, папилломатоз. Другими способами определить патологические процессы, ассоциированные с этими возбудителями, не выйдет. Многие из них потенциально опасны. Некоторые штаммы вируса папилломы человека крайне агрессивны, онкогенны. Могут привести к сложным формам рака.
Потому так важна ранняя диагностика. Злокачественные процессы на начальной стадии. Пока еще симптомов нет. С помощью ПЦР-анализа удается обнаружить аномальные клетки, которые имеют одну, а то и несколько мутаций генетического материала. Как правило, это случайные находки.
Например, при анализе соскоба со слизистых оболочек полости рта заядлого курильщика. Благодаря такому способу удается обнаружить проблему на ранней стадии, когда как таковой опухоли еще нет. Но предпосылки — представлены в полном объеме. Исследование иммунной реакции на того или иного возбудителя. Изучают особые вещества, которые отвечают за инактивацию и сдерживание аномальных агентов, инфекционных структур.
Методика отличается от схожего по целям ИФА. Обследование на предмет генетических аномалий. В рамках диагностики наследственных патологических процессов. В качестве основного метода. Также с помощью ПЦР возможно установление отцовства, родства двух людей.
Но это тема для отдельного разговора. Для исследования забирают биоматериал. Какой именно — зависит от конкретных показаний. Обычно берут мазки со слизистых оболочек полости рта, половых органов, уретры.
За это Муллис получил Нобелевскую премию по химии. Известно, что еще в начале 1970-х годов похожий метод был представлен другим ученым, однако задумку так и не смогли реализовать. Позже анализ был значительно усовершенствован и широко используется в биологической, биохимической и медицинской практике. Как работает ПЦР Для проведения анализа необходимо сложное, современное оборудование. В большую машину кладут частичку вируса, но она его не распознает, затем добавляются специальные компоненты, праймеры, которые позволяют сделать большое количество этих цепочек РНК. Их становится так много, что машина начинает их «видеть».
Даже если есть хоть самая маленькая РНК вируса, например, коронавируса, это позволяет создать множество копий инфекции, что помогает определить, присутствует она в организме или нет. Метод дает результат практически стопроцентной точности. Там находится большое число нуклеотидов, из которых строится будущая РНК. Она сначала разрушается, а потом заново выстраивается. Реакция называется цепной, потому что очень быстро это происходит. Как только копий становится много, сразу начинается считывание». Применение ПЦР ПЦР-тест обнаруживает наличие возбудителей вирусных заболеваний, когда другими методами этого сделать нельзя.
При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается интеркалирует плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне 254 - 310 нм. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра 590 нм. В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма. Размер неспецифических ампликонов может быть как больше, так и меньше по сравнению с «положительным контролем». В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные. В то же время препарат ДНК, подготовленный для ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью, для чего используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль», который представляет собой любой стандарт ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда, например, используют р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций пришивают участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. Если «внутренний контроль» внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК «внутреннего контроля» в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то, независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, «внутренний контроль» станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных тяжелых , чем ампликон микроорганизма. Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси свидетельствует о нормальном прохождении реакции амплификации и отсутствии ингибиторов. Если ампликоны нужного размера и «внутреннего контроля» не образовались, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК. Несмотря на всю привлекательность такого подхода, у него есть существенный изъян. Так, если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации резко снижается из-за конкуренции с «внутренним контролем» за праймеры. Это принципиально важно при низких концентрациях ДНК в исследуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам. Тем не менее, при условии решения проблемы конкуренции за праймеры этот способ контроля эффективности амплификации, безусловно, будет весьма полезен. Метод горизонтального электрофореза Одним из методов визуализации результатов амплификации является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле. Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов. Метод вертикального электрофореза Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют. Метод гибридизационных зондов В качестве альтернативы электрофоретическому методу детекции, имеющему некоторые недостатки: субъективность чтения результатов, ограничения по определению ДНК различных микроорганизмов в одной реакции, могут быть предложены гибридизационные схемы детекции. В этих схемах образующийся в результате амплификации фрагмент ДНК гибридизуется образует 2-х цепочечные комплексы - "гибриды" со специфическим олигонуклеотидным зондом. Регистрация таких комплексов может быть проведена колориметрически или флуориметрически. Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Кинетическая кривая в координатах "Уровень репортерной флуоресценции - цикл амплификации" имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии: 1. Стадию инициации когда ПЦР-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой. Экспоненциальную стадию в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР. Плато стадию насыщения. По нарастанию интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения, прилагаемого к амплификатору, вычисляется концентрация исходной матрицы ДНК. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4. В настоящее время преимущество ПЦР-анализа перед культуральным методом обнаружения микроорганизмов состоит в следующем:.
Уже через 30 - 40 секунд связи нуклеотидов разрываются и вместо двойной цепи получаются две одиночные. Надо заметить, что если после этого, снова, просто понизить температуру, то разделившиеся половинки достаточно быстро находят друг друга и всё возвращается, практически, к исходному состоянию. Следовательно, нам надо не дать соединиться половинкам интересующей нас ДНК. Как этому помешать? Тогда, место на половинке-основании окажется занято, при попытке присоединения, свойство комплементарности окажется нарушено, и вторая половинка не сможет прицепиться на своё "законное" место. Это "что-то" названное праймером, синтезируется в научной или промышленной лаборатории и представляет собой цепочку синтетических нуклеотидов олигонуклеотидов , расположенных в таком же порядке, как и у того вируса бактерии и так далее , на который делается анализ. Например, если делают анализ на хламидии, то праймер соответствует специфическому участку гена, кодирующего главный белок наружной мембраны МОМР Chlamydia trachomatis. Итак, вторая стадия - присоединение праймеров к ДНК также называется отжигом длится от 20 до 60 секунд. Температура отжига равна 50 - 65 градусам для каждого вида возбудителей, то есть для каждого праймера, она своя. На этом этапе мы уже разделили ДНК на две половинки и не даём им соединиться. Теперь самое время достроить каждую половинку до полноценной ДНК. Но температура, при которой это должно произойти, очень высока, по меркам молекулярной биологии — более 70 градусов выше температуры отжига. Проблема была решена благодаря открытию уникального фермента taq-ДНК-полимеразы, содержащегося у бактерий, обитающих в гейзерах. Особенность этого фермента заключается в его исключительной термостойкости период полужизни при 95 градусах составляет 40 минут и высокой рабочей температуре — оптимум работы 72градуса. В клетках, фермент ДНК-полимеразы отвечает за копирование и "ремонт" ДНК и способен удлинять короткие нуклеотидные цепочки праймеров, последовательно присоединяя к одному из концов праймера дополнительные нуклеотиды, таким образом, достраивая цепь до конца. Так ДНК копирует саму себя. Третий этап - достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от конца к концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор "кирпичики" - все те же производные аденина, гуанина, цитозина и тимина. Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой Taq-полимеразой и проходит при температуре 70 - 72 градуса. Время протекания синтеза зависит от длины достраиваемого фрагмента и обычно принимается равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. Теперь мы имеем две двойные цепочки ДНК вместо одной, исходной. Ну а дальше процесс повторяется. Опять температура повышается до 93 - 95 градусов, цепочки разъединяются...
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
| Анализ методом ПЦР. Что такое ПЦР-диагностика и для чего она используется | Узнайте, что такое ПЦР-анализ, виды тестов и показания к проведению диагностики, преимущества и недостатки метода. |
| ПЦР анализ – что это такое, как делают ПЦР анализ крови. | ПЦР с анализом результатов по конечной точке (End-point PCR) – это модифика-ция метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуо-ресценции после амплификации. |
| ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции | С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. |
| История открытия современных методов молекулярной диагностики | Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. |
История открытия современных методов молекулярной диагностики
| Улучшение качества обследования пациентов с помощью ПЦР-лаборатории | Полимеразная цепная реакция или ПЦР — это метод создания множества копий определенного участка ДНК in vitro (в пробирке, а не в организме). |
| ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции | производстве и внедрении высокотехнологичного оборудования и реагентов для исследований методом ПЦР. |
Микробиологические исследования
Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды вода, почва и т. В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза , гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв.
Каждый из праймеров сопоставим комплементарен с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения гибридизации матрицы с праймером отжиг , последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое.
Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями.
Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом.
Время стадии — 0,5 - 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации.
Температура элонгации зависит от полимеразы.
При использовании нескольких эндонуклеаз рестрикции на одном образце можно составлять рестрикционные карты. Располагая такой информацией, можно идентифицировать на ДНК биологически важные участки. Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет оценить гомологию между ними.
Анализируя рестрикционные карты, можно сравнивать определенные участки ДНК разных видов животных без определения их нуклеотидной последовательности. Таким образом, например, было установлено, что хромосомные участки, кодирующие цепи гемоглобина у человека, орангутанга и шимпанзе сохранились в практически неизменном виде в течение последних 5 - 10 млн. Метод рестрикционного картирования позволяет увидеть крупные генетические изменения, такие как делеции или инсерции. При этом происходит уменьшение или увеличение рестрикционных фрагментов, а также исчезновение или возникновение сайтов рестрикции.
Поскольку по химическому строению ДНК не отличается у разных организмов, можно сшивать ДНК из любых источников, и клетка не сможет отличить полученную молекулу от своей собственной ДНК. Рекомбинантный фермент выделен из штамма кишечной палочки E. Для улучшения результатов лигирования, общая рекомендация заключается в создании нескольких реакций с различными вставками: вектор молярных соотношений, как правило, в диапазоне от 1:1 до 5:1. Для менее эффективных лигирований, как и для фрагментов ДНК с тупыми концами, часто рекомендуется добавление инертных макромолекул, таких как полиэтиленгликоль ПЭГ , чтобы увеличить эффективную концентрацию компонентов реакции и тем самым повысить эффективность лигирования.
Разделение молекул ДНК и белков Метод гель-электрофореза Электрофорез - это движение дисперсных частиц относительно жидкости под действием пространственно однородного электрического поля. Часто приходится иметь дело со смесью молекул ДНК разной длины. Например, при обработке химически выделенной из организма ДНК рестриктазами как раз получится смесь фрагментов ДНК, причем их длины будут различаться. Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза.
ДНК помещают в гель обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением , который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду аноду , причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров смесей фрагментов ДНК известных длин можно установить длину молекул в образце Физический принцип метода заключается в следующем.
Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, то есть сформируется электрическое поле. Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза.
Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая гидрофильная пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции.
Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров.
Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится. В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели ПААГ и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов.
Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла.
К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует. А Электрофорез в полиакриламидном геле Рис.
Электрофорез в полиакриламидном геле чаще используется для белков Электрофорез в полиакриламидном геле ПААГ или PAGE - метод, широко используемый для разделения биологических макромолекул в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Подвижность является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Как и во всех формах гель-электрофореза, молекулы могут работать в своем естественном состоянии, сохраняя структуру молекул более высокого порядка, или может быть добавлен химический денатурант, чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную линейную цепь, подвижность которой зависит только от ее длины и отношение массы к заряду. Таким образом, разделяют т.
Базовые приготовления Образцы могут представлять собой любой материал, содержащий белки. Они могут быть получены биологически, например, из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, проб окружающей среды или очищенных белков. Образец для анализа необязательно смешивают с химическим денатурантом, обычно SDS для белков. SDS - это анионный детергент, который денатурирует вторичные и недисульфидно-связанные третичные структуры и дополнительно придает отрицательный заряд каждому белку пропорционально его массе.
Приготовление акриламидных гелей Гели обычно состоят из акриламида, бисакриламида, необязательного денатурирующего вещества SDS и буфера с отрегулированным pH. Раствор можно дегазировать под вакуумом, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время полимеризации. Источник свободных радикалов и стабилизатор, такой как персульфат аммония и TEMED, добавляются для инициирования полимеризации. Реакция полимеризации создает гель из-за добавленного бисакриламида, который может образовывать поперечные связи между двумя молекулами полиакриламида.
Гели, как правило, полимеризуются между двумя стеклянными пластинами в гелеобразователе, с гребнем, вставленным вверху для создания лунок для образца. После того, как гель полимеризован, «расческа» может быть удалена, и гель готов для электрофореза. Электрофорез В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и цели эксперимента. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или разными.
Электрическое поле воздействует на гель, заставляя отрицательно заряженные белки мигрировать через гель от отрицательного электрода катода к положительному электроду аноду. В зависимости от их размера каждая биомолекула движется по-разному через матрицу геля: маленькие молекулы легче проникают через поры в геле, в то время как более крупные имеют большую сложность. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; Миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты обычно менее точны, чем при более низких напряжениях. По истечении заданного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера.
Меньшие биомолекулы движутся дальше вниз по гелю, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Следовательно, биомолекулы могут быть разделены примерно в соответствии с размером, который зависит в основном от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации высшего порядка в нативных условиях. После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос внутри геля. Для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера обычно используют маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой на отдельной дорожке в геле.
Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем обычно полиакриламидным. Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру. Элекрофорез в агарозном геле Самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля.
Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом.
Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов: Силы образованного электрического поля; Относительной степени «боязни» воды образцов; Температурной кривой буфера и ионной силы. Рисунок 18. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете слева. Вторая слева дорожка-маркер с известными длинами фрагментов.
Справа - Установка для проведения электрофореза в геле. Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ флуоресцирующих, в присутствии ДНК традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества. Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков. Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК.
В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце.
Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем.
Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10—1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть. Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего Edwin Southern. Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза.
На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе.
После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке рис.
Это связано с тем, что в воздухе постоянно присутствует невероятный коктейль из фрагментов ДНК всевозможных живых организмов, и в процессе подготовки к проведению реакции образец может быть загрязнен — возможно «ложное срабатывание». Оценивать результаты реакции должен практический врач, который лечит конкретного больного. Дело в том, что далеко не всегда положительный ответ теста означает наличие заболевания. Например, человек пролечился от какого-либо заболевания, но погибший и уже не опасный возбудитель будет еще некоторое время «разбираться на запчасти» защитной системой организма. Если в этот момент сделать ПЦР — результат окажется положительным. Другой вариант — это отрицательный результат ПЦР при наличии даже явной клинической картины. Одна из наиболее возможных причин — материал для исследования был взят «не оттуда». Образец должен брать квалифицированный врач, строго следуя инструкции, которую ему дает лаборатория.
Когда следует бежать в лабораторию, чтобы проанализировать итоги вашего летнего отпуска? Специалисты советуют делать это в следующих случаях: выделения, зуд, чувство жжения в области половых органов, резко изменившийся запах от половых органов, дискомфорт при мочеиспускании, необычный характер выделений цвет, количество, консистенция , случайный половой контакт без применения презерватива. Чаще всего его используют для диагностики именно заболеваний, передающихся половым путем. В этих случая обычно материалом для исследования является мазок. Например, мазок на хламидии у женщин берут из влагалища, у мужчин — из уретры. Для анализа биоматериалом могут быть и слюна, и кровь, и моча, и выделения половых органов. В любом случае нельзя ограничиваться только одним методом. Лучше всего комбинировать различные методы исследования — помимо определения самого возбудителя методом ПЦР необходимо оценивать и иммунный ответ организма, который определяется традиционными уже серологическими методами, например, ИФА.
Широта исследуемого клинического материала В качестве образца при полимеразной цепной реакции может быть использован не только биологический материал от больного, но также и многие другие субстраты, в которых могут быть идентифицированы молекулы ДНК с высокой чувствительностью, например, вода, почва, продукты питания, микроорганизмы, смывы и многое другое. Все перечисленные выше достоинства этого уникального метода - высокая чувствительность и специфичность, идентификация инфекционного агента и проведение генотипирования любого гена человека, высокая эффективность и экономия времени, универсальность приборной базы — позволяют широко применять сегодня метод ПЦР в клинической диагностике, медицинской практике, научных исследованиях, контроле качества и многих других областях. Применение ПЦР Области применения полимеразной цепной реакции как современного метода молекулярной биологии разнообразны. Во многом это обусловлено широтой материала, который можно анализировать практически все, из чего можно выделить более-менее качественую ДНК может стать объектом исследования , а также подобранных праймеров. Основные области применения ПЦР: клиническая медицина.
ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
Исследования, проводимые одним из широко применяемых методов – методом, основанным на полимеразной цепной реакции (ПЦР), являются наиболее точными и достоверными. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это прямой метод выявления возбудителя, то есть с помощью него можно определить РНК вируса со слизистой ротоглотки или носоглотки, то есть можно определить сам коронавирус. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. При диагностике туберкулёза метод ПЦР применяют в случае получения положительных результатов при проведении плановых аллергических исследований в благополучных по туберкулёзу хозяйствах. Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. Характеристика метода ПЦР. Исследование при помощи полимеразной цепной реакции относится к количественным анализам.
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
Эпителиальные соскобы со слизистых оболочек. Обычно используются для диагностики заболеваний, передающихся половым путем ЗППП , таких как гонорея, хламидиоз, микоплазмоз, уреаплазмоз, трихомониаз, гарднереллез, герпетическая и другие инфекции, поражающие слизистые оболочки. Чаще всего используют биоптаты желудка и двенадцатиперстной кишки для выявления хеликобактерной инфекции. Кровь, плазма, сыворотка. Как подготовиться к сдаче анализа? Достоверность результата ПЦР напрямую зависит от правильности сдачи материала на обследование. Материал не должен быть загрязнен, иначе результат исследования не будет объективен. К наиболее важным рекомендациям перед сдачей анализа ПЦР относятся следующие требования: Моча сдается утром в стерильный контейнер. Анализ крови на инфекции необходимо сдавать на голодный желудок в утреннее время. Не стоит проявлять половую активность за сутки до проведения анализа.
Результат анализа будет готов через 1,5-2 суток после проведения рассматриваемой процедуры. Встречаются такие ситуации, когда результат может быть подготовлен в тот же день.
Для каждой реакции есть свои праймеры — кусочки, из которых будут создаваться новые РНК.
Тест небыстрый — по времени может занимать около суток. Кроме этого, нужен обученный, высокопрофессиональный персонал. Сами аппараты довольно громоздкие, хотя сейчас уже есть и установки меньшего размера.
Но чем больше машина, тем больше она может прочитать. Это система не для мобильного использования". Загрязнение материала для теста может произойти также, если при его транспортировке были допущены ошибки, из-за непригодности реагентов, попадании в них крови, клеток эпителия, большого количества слизи.
Лаборатория научно-исследовательского института скорой помощи имени Н. Его применяют для амплификации РНК. Вложенная ПЦР нужна для уменьшения побочных реакций, для этого в амплификатор помещают два праймера.
Количественная ПЦР применяется для наблюдения за изменением цепной реакции. Ступенчатая ПЦР позволяет снизить связывание праймеров. Его делают при помощи прибора, в котором есть картридж, определяющий только одну инфекцию, например, коронавирус.
Кроме него аппарат ничего не видит, как и при обычном ПЦР, однако в таком случае результат можно получить намного быстрее".
Благодаря ИФА, реально подтвердить или опровергнуть факт распространенности инфекционного процесса в любом участке организма. Метод ПЦР же предназначен для обнаружения возбудителя только в исследуемом образце, то есть биологических жидкостях, фрагментах органов и тканей, которые были предоставлены для исследования. Для проведения иммуноферментного анализа пригоден абсолютно любой материал для исследования кровь, моча, слюна, частички органов и тканей. Потому как иммуноглобулины при ответе организма на проникновение возбудителя могут находиться где угодно. Для исследования путем полимеразной цепной реакции берется тот биологический материал, где предположительно может присутствовать возбудитель. Как видно из перечисленных особенностей каждого лабораторного исследования различия между ИФА и методом ПЦР существенные. Если коротко сформулировать, то ИФА направлен на обнаружение продуктов жизнедеятельности белков-маркеров. А ПЦР нацелен на установление конкретного возбудителя, который может относиться к группе бактерий, вирусов или грибков.
С той лишь целью, чтобы сразу получить полномасштабную клиническую картину о происходящих патологических процессах внутри организма пациента. Теперь, если когда-нибудь станет выбор, какой вид диагностики предпочесть ПЦР либо ИФА, у человека, ознакомившегося с предложенной информацией, вопросов не возникнет. Когда речь идет о здоровье, дабы не допустить развития инфекционного процесса до неизлечимой стадии. Лучше сделать полное обследование, чтобы обнаружить инфекцию как можно раньше и провести своевременное лечение.
Еще одной предпосылкой к появлению нового метода явилась расшифровка нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. ПЦР стала действительно недорогой и технологичной методикой в результате использования ДНК-полимеразы, выделенной из термофильной бактерии Thermus aquaticus, обитающей в трубопроводах горячей воды. Универсальным носителем генетической информации и наследственных признаков у всех существующих на Земле организмов является дезоксирибонуклеиновая кислота ДНК. Исключение составляют только некоторые микроорганизмы, например, вирусы, носителем генетической информации у которых является РНК — одноцепочечная рибонуклеиновая кислота. ДНК представляет собой двойную нить, скрученную в спираль. Каждая нить состоит из последовательности химически связанных нуклеотидов.
Две полинуклеотидные цепи в ДНК соединяются двумя или тремя водородными связями, возникающими между азотистыми основаниями.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Полимеразная цепная реакция или ПЦР — это метод создания множества копий определенного участка ДНК in vitro (в пробирке, а не в организме). ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей. 40. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени: Методиче-ское пособие для лаборантов / Сост. Молекулярно-биологические исследования с применением метода полимеразной цепной реакций (ПЦР).
Суть метода ПЦР
- Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?
- Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
- Полимеразная цепная реакция: как одна технология изменила мир?
- Принципы ПЦР-диагностики. Реферат. Медицина, физкультура, здравоохранение. 2013-05-03