Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе).
Все под контролем! Правильный способ использования внутреннего контрольного образца (ВКО)
Исследование является одним из основных методов диагностики различных инфекционных заболеваний с половым путем передачи. К ним относятся патологические процессы, вызванные: вирусами герпетическая, папилломавирусная инфекция , ВИЧ СПИД, вирусные гепатиты с парентеральным путем передачи специфическими бактериями сифилис, гонорея, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз простейшими трихомониаз Полимеразная цепная реакция также может использоваться для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенными грибами кандидоз. Какой материал исследуется? Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека. В зависимости от локализации и характера диагностируемого заболевания, это может быть: мазок со слизистой оболочки урогенитального тракта моча.
Правила получения иподготовки материала для ПЦР-диагностики. Осуществлять взятие клинического материала, строго следуя инструкции, только стерильными одноразовыми инструментами в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры.
Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, предоставляемой фирмой-производителем наборов реагентов в случаях, где использование транспортной среды является необходимым. Сразу после взятия плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек. При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгиваний и расплескиваний, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей. При переносе клинического материала из пробирок, флаконов в новые использовать только отдельные одноразовые стерильные наконечники с аэрозольными барьерами. Строго соблюдать правила хранения и транспортирования клинических проб. Охлаждающие элементы перед транспортированием клинического материала замораживать до необходимой температуры.
Для проведения пробоподготовки используют ПЦР-боксы. Чтобы смешать необходимые для исследований реагенты используют центрифуги и вортексы. Чтобы извлечь реакционную смесь и прочие материалы применяют автоматические дозаторы. Помещения иоборудование лаборатории ПЦР. Рабочие зоны представляют собой боксированные помещения, состоящие из бокса и предбокса, соответствующим образом промаркированы. В рабочей зоне 1 осуществляют прием материала, его маркировку, регистрацию в специальном журнале, первичную подготовку.
В рабочей зоне 2 проводят выделение и очистку нуклеиновых кислот микроорганизмов из проб, подготовленных в рабочей зоне 1. В рабочей зоне 3 осуществляют приготовление реакционных смесей, проведение обратной транскрипции. В рабочей зоне 4 проводят амплификацию нуклеиновых кислот и учет результатов амплификации. Результаты ПЦР анализа на инфекции обычно выглядят как таблица. В первой колонке идут виды возбудителей, определенных в ходе анализа.
Данное оборудование, точнее, технологический цикл секвенирования с использованием оборудования Illumina, обеспечивает высокую скорость расшифровки секвенирования ДНК и относительно низкую стоимость исследования, позволяющую использовать этот современный диагностический метод в широкой клинической практике. Интерпретация полученных данных проводится в соответствии с постоянно дополняемыми международными информационными базами мутаций. В нашей лаборатории работают уникальные специалисты, имеющие профессиональную подготовку и богатый подтвержденный опыт как клинической, так и научной работы в направлении секвенирования генома. Вовлеченность в международное профессиональное сообщество и постоянное взаимодействие с клиническими онкологами и химиотерапевтами лечебных центров МИБС позволяет оперативно реагировать на потребности отрасли. Именно поэтому услуги молекулярно-генетической лаборатории МИБС востребованы онкологами по всей РФ - с конца 2021 года образцы для выполнения исследования можно передать в любом из региональных центров МИБС либо отправить курьерской службой для получения подробной информации о логистике образцов, обратитесь любым из доступных на сайте способов.
К тому же большинство исследований, связанных с определением эффективности лечения, могут быть выполнены в нашей лаборатории за счет ОМС , независимо от региона проживания гражданина РФ. Комплексное геномное профилирование КГП определяет уникальный молекулярный профиль опухоли, изучая список из 324 генов, значимых с точки зрения лечения онкологических заболеваний. Тест выполняется в рамках одного биоматериала парафиновые блоки образцов опухоли либо образец крови, в зависимости от заболевания во внешней лаборатории Foundation Medicine Пензбург, Германия. Результаты КГП позволяют оптимизировать проводимую противоопухолевую терапию у детей и взрослых, назначив персонализированное таргетное лечение при любых солидных опухолях, гемобластозах, саркомах. По результатам проведения КГП также определяются клинические исследования, в которых могут принять участие пациенты, исходя из их геномного профиля. Наши пациенты имеют возможность передать образцы на тестирование, заключив договор на получение услуги в любом из 79 региональных диагностических центров МИБС в более чем 60 городах РФ. Общее время ожидания результатов КГП, включая транспортировку, составит 5-6 недель. Отчет, полученный из Германии, будет содержать информацию о выявленных генетических изменениях, клинически эффективных видах терапии и ведущихся клинических исследованиях, участие в которых рекомендовано пациенту, исходя из его геномного профиля. ДНК-тест рисков наследственного рака на основе NGS С появлением метода секвенирования генома нового поколения, позволяющего одномоментно проанализировать широкую панель генов и сравнить с имеющейся всемирной базой выявленные мутации, на новый виток развития выходят программы предупреждения и ранней диагностики широкого ряда онкологических заболеваний - программы скрининга, которые включают исследование наследственных рисков развития онкозаболеваний.
Благодаря ферментативной реакции множественного копирования молекул генетического материала ПЦР обладает высокой чувствительностью.
Для выявления и идентификации достаточно нескольких фрагментов ДНК возбудителей в исследуемом биологическом материале. Когда проводится анализ? ПЦР получила широкое распространение в различных областях практической медицины. Исследование является одним из основных методов диагностики различных инфекционных заболеваний с половым путем передачи.
Как проводят анализ методом ПЦР: описание процедуры
Этот метод используется во всем мире при разработке тест-систем на основе ОТ-ПЦР, в том числе для диагностики РНК-содержащих вирусов, к коим относится и новый коронавирус SARS-CoV-2. 6) автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа Метод ПЦР в реальном времени основан на детектировании сигнала флуоресценции, позволяющем наблюдать процесс накопления продукта в процессе реакции. читайте в медицинском журнале клиники Адмиралтейские Верфи. Метод амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) или ОТ-ПЦР в диагностике текущей инфекции. Диагноз COVID-19 устанавливается путем выявления РНК SARS-CoV-2 при помощи МАНК или ОТ-ПЦР.
Что такое ПЦР
| Принципы ПЦР-диагностики | Цифровая ПЦР – высокоточный современный метод количественного анализа нуклеиновых кислот. |
| ПЦР анализ: что это такое? | ПЦР диагностика является быстрым и точным методом исследования, когда невозможно вывить возбудителя другими методами. |
Рибосомальная 16S РНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование биополимеров
При самолечении и самостоятельной сдаче анализов для исследования методом ПЦР в сетевой лаборатории высок риск того, что вы будете годами лечиться от несуществующей болезни. Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR) — метод молекулярной биологии, позволяющий создать копии определенного фрагмента ДНК из исходного образца, повысив его содержание в пробе на несколько порядков. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это метод молекулярно-генетической диагностики, позволяющий обнаружить в организме человека различные инфекционные заболевания.
ПЦР анализ: что это такое?
Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. Один метод ПЦР породил множество тестов, отвечающих разным тематикам исследований во многих отраслях человеческой деятельности. В России метод полимеразной цепной реакции был внедрен и начал использоваться в 1995 г. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе. производстве и внедрении высокотехнологичного оборудования и реагентов для исследований методом ПЦР. ПЦР, или полимеразная цепная реакция, представляет собой метод лабораторного исследования различных биологических жидкостей.
Микробиологические исследования
Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. Анализ крови методом ПЦР. ПЦР (полимеразная цепная реакция) является одним из высокоточных методов, с помощью которого осуществляют диагностику инфекций различного характера, а в его основе лежит изучение генетических образцов материала человека. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. читайте в нашей статье.
Что такое ПЦР анализ
Для понимания этого явления напомним, что основой хранения наследственной информации и основой жизни является ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота. ДНК состоит из двух нитей, которые сформированы из азотистых оснований — нуклеотидов. Нуклеотидов всего четыре. Нуклеотиды обладают свойством комплиментарности, то есть с определенным типом нуклеотида может связаться только определенный тип другого нуклеотида. Например известны нуклеотиды аденин, тимидин, цитозин и гуанин. Из них аденин может связываться с тимидином, а цитозин с гуанином.
Но не наоборот. В последовательности нуклеотидов закодирована уникальная для каждого живого организма информация. Будь то человек или вирус. У некоторых вирусов наследственная информация закодирована в другой нуклеиновой кислоте —РНК. Поэтому, идентифицировав ДНК, можно с уверенностью утверждать, что она принадлежит определенному микроорганизму.
Упрощенно такой механизм идентификации можно сравнить с отпечатками пальцев. Рисунок линий на пальцах уникален для каждого человека. Нет необходимости видеть портрет. Достаточно просто сверить отпечаток пальца с базой данных. Таким же образом работает и ПЦР.
Выделив ДНК возбудителя от больного, можно совершенно четко его идентифицировать. При этом даже не важно, живой возбудитель или уже нежизнеспособный. Метод ПЦР с одинаковым успехом, в отличие от бактериологического посева, может идентифицировать присутствие возбудителя.
Результаты пцр анализа можно получить через 1,5-2х суток после сдачи материала. В некоторых случаях результат готов в первый же день, и вот что они могут означать: Отрицательный результат показывает, что в диагностируемом материале отсутствует искомый инфекционный возбудитель. В некоторых случаях производят количественное определение микроорганизмов. Это особенно актуально при заболеваниях, вызванных условно-патогенными микроорганизмами. Так как данные бактерии проявляют свое негативное воздействие лишь при избыточном количестве. Также количественный анализ ПЦР важен для выбора терапевтической тактики и с целью контроля над лечением таких вирусных инфекций, как ВИЧ и вирусы гепатита. Насколько точна ПЦР диагностика инфекций? Метод ПЦР отличается высокой точностью, специфичностью и чувствительностью. Это означает, что данный анализ способен: точно определить наличие или отсутствие инфекции; точно указать, что именно это за инфекция специфичность ; обнаружить инфекцию даже при очень низком содержании ДНК микробов в биологическом материале, который был подвергнут исследованию чувствительность. ПЦР анализ: цена и сроки Цена конкретного анализа будет зависеть от того, на какую инфекцию вы будете проверяться. Примерные цены и сроки: ИППП: 300-500 руб, сроки — 1 день; Вирус Эпштейна-Барра, вирус папилломы человека, герпеса, цитомегаловирус: 300-500 руб, сроки — 1 день; Гепатит A, B, C, D, G: качественный анализ 650 руб, количественный анализ 2000 руб. Чтобы сэкономить средства, можно выбирать фиксированный пакет анализов.
Юлия К Нашла клинику в Инстаграм. Мне нужно было срочно сдать анализы, поэтому не думая приехала сюда. Процедурный был свободный, так что меня сразу взяли, через 20 минут уже были готовы ответы. Хочу сказать вам спасибо за возможность быстро и без головной боли получить ответы на руки. Анна П. Всем советую сюда обращаться, по крайней мере на УЗИ по беременности. Со второй беременностью также обращалась сюда, уже в 2021. Персонал отличный! Когда делают УЗИ тебе все видно на экране телевизора. По ходу исследования все рассказывают и дают фотографию малыша. Яна Гудина У Регины Рубеновны проходила комплексное обследование. И знаете, впервые для меня поход к гинекологу не был проблематичным. Все аккуратно, тактично, по человечески. Осталась очень довольна и уровнем и ценой. Большое спасибо!
Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты. Также рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид последовательность из 4-х пар оснований и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Рестрикционный анализ ДНК Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции, которые приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем. Основные переменные параметры — это температура инкубации и состав буфера. К температурному режиму предъявляются достаточно жесткие требования, тогда как различия между буферами чаще всего лишь незначительны. Рестрикционный анализ ДНК широко используется в молекулярно-биологических исследованиях и прикладных работах и является одним из наиболее важных инструментов при изучении ДНК. При помощи эндонуклеаз рестрикции можно исследовать ДНК различных вирусов, бактерий, животных, растений. Как правило, продукты расщепления ДНК анализируются с помощью гель-электрофореза в агарозном или акриламидном геле, а полученная таким образом картина разделения фрагментов ДНК в виде определенного, отличающегося для разных ферментов, набора полос и является результатом рестрикционного анализа той или иной ДНК. Короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При сравнительно высокой концентрации агарозы большие фрагменты вообще не могут проникнуть в гель. В процессе миграции рестрикционные фрагменты не деградируют, их можно вымывать в виде биологически активных двухцепочечных молекул. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает рестрикционному фрагменту, молекулярную массу которого можно определить, проведя калибровку с помощью ДНК с известными молекулярными массами подробнее см. При использовании нескольких эндонуклеаз рестрикции на одном образце можно составлять рестрикционные карты. Располагая такой информацией, можно идентифицировать на ДНК биологически важные участки. Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенной последовательности нуклеотидов в данном участке, сравнение таких карт для двух или более родственных генов позволяет оценить гомологию между ними. Анализируя рестрикционные карты, можно сравнивать определенные участки ДНК разных видов животных без определения их нуклеотидной последовательности. Таким образом, например, было установлено, что хромосомные участки, кодирующие цепи гемоглобина у человека, орангутанга и шимпанзе сохранились в практически неизменном виде в течение последних 5 - 10 млн. Метод рестрикционного картирования позволяет увидеть крупные генетические изменения, такие как делеции или инсерции. При этом происходит уменьшение или увеличение рестрикционных фрагментов, а также исчезновение или возникновение сайтов рестрикции. Поскольку по химическому строению ДНК не отличается у разных организмов, можно сшивать ДНК из любых источников, и клетка не сможет отличить полученную молекулу от своей собственной ДНК. Рекомбинантный фермент выделен из штамма кишечной палочки E. Для улучшения результатов лигирования, общая рекомендация заключается в создании нескольких реакций с различными вставками: вектор молярных соотношений, как правило, в диапазоне от 1:1 до 5:1. Для менее эффективных лигирований, как и для фрагментов ДНК с тупыми концами, часто рекомендуется добавление инертных макромолекул, таких как полиэтиленгликоль ПЭГ , чтобы увеличить эффективную концентрацию компонентов реакции и тем самым повысить эффективность лигирования. Разделение молекул ДНК и белков Метод гель-электрофореза Электрофорез - это движение дисперсных частиц относительно жидкости под действием пространственно однородного электрического поля. Часто приходится иметь дело со смесью молекул ДНК разной длины. Например, при обработке химически выделенной из организма ДНК рестриктазами как раз получится смесь фрагментов ДНК, причем их длины будут различаться. Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза. ДНК помещают в гель обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением , который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду аноду , причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров смесей фрагментов ДНК известных длин можно установить длину молекул в образце Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, то есть сформируется электрическое поле. Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая гидрофильная пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится. В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели ПААГ и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует. А Электрофорез в полиакриламидном геле Рис. Электрофорез в полиакриламидном геле чаще используется для белков Электрофорез в полиакриламидном геле ПААГ или PAGE - метод, широко используемый для разделения биологических макромолекул в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Подвижность является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Как и во всех формах гель-электрофореза, молекулы могут работать в своем естественном состоянии, сохраняя структуру молекул более высокого порядка, или может быть добавлен химический денатурант, чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную линейную цепь, подвижность которой зависит только от ее длины и отношение массы к заряду. Таким образом, разделяют т. Базовые приготовления Образцы могут представлять собой любой материал, содержащий белки. Они могут быть получены биологически, например, из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, проб окружающей среды или очищенных белков. Образец для анализа необязательно смешивают с химическим денатурантом, обычно SDS для белков. SDS - это анионный детергент, который денатурирует вторичные и недисульфидно-связанные третичные структуры и дополнительно придает отрицательный заряд каждому белку пропорционально его массе. Приготовление акриламидных гелей Гели обычно состоят из акриламида, бисакриламида, необязательного денатурирующего вещества SDS и буфера с отрегулированным pH. Раствор можно дегазировать под вакуумом, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время полимеризации. Источник свободных радикалов и стабилизатор, такой как персульфат аммония и TEMED, добавляются для инициирования полимеризации. Реакция полимеризации создает гель из-за добавленного бисакриламида, который может образовывать поперечные связи между двумя молекулами полиакриламида. Гели, как правило, полимеризуются между двумя стеклянными пластинами в гелеобразователе, с гребнем, вставленным вверху для создания лунок для образца. После того, как гель полимеризован, «расческа» может быть удалена, и гель готов для электрофореза. Электрофорез В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и цели эксперимента. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или разными. Электрическое поле воздействует на гель, заставляя отрицательно заряженные белки мигрировать через гель от отрицательного электрода катода к положительному электроду аноду. В зависимости от их размера каждая биомолекула движется по-разному через матрицу геля: маленькие молекулы легче проникают через поры в геле, в то время как более крупные имеют большую сложность. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; Миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты обычно менее точны, чем при более низких напряжениях. По истечении заданного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера. Меньшие биомолекулы движутся дальше вниз по гелю, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Следовательно, биомолекулы могут быть разделены примерно в соответствии с размером, который зависит в основном от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации высшего порядка в нативных условиях. После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос внутри геля. Для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера обычно используют маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой на отдельной дорожке в геле. Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем обычно полиакриламидным. Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру. Элекрофорез в агарозном геле Самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля. Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике? Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов: Силы образованного электрического поля; Относительной степени «боязни» воды образцов; Температурной кривой буфера и ионной силы. Рисунок 18. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете слева. Вторая слева дорожка-маркер с известными длинами фрагментов. Справа - Установка для проведения электрофореза в геле. Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ флуоресцирующих, в присутствии ДНК традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества. Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков. Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК. В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце.
ПЦР в режиме реального времени – новейшие технологии в диагностике инфекций
| ПЦР-анализ: метод диагностики, выявляемые инфекции | ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это прямой метод выявления возбудителя, то есть с помощью него можно определить РНК вируса со слизистой ротоглотки или носоглотки, то есть можно определить сам коронавирус. |
| ПЦР анализ: когда нужно сдавать, как проводится исследование, методы диагностики заболеваний | Цифровая ПЦР – высокоточный современный метод количественного анализа нуклеиновых кислот. |
| Принципы ПЦР-диагностики. Реферат. Медицина, физкультура, здравоохранение. 2013-05-03 | Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл. |
Когда назначается ПЦР-диагностика?
- Метод ПЦР диагностики: сферы применения, подготовка к исследованию, анализы на инфекции
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности
- История открытия и разработка метода пцр
- Принципы ПЦР-диагностики
- ПЦР-диагностика
- ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Чем объясняется популярность ПЦР в настоящее время?
- Выберите любимую аптеку
- Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа
- Что такое ПЦР-тест? Методика, преимущества и недостатки анализа | РИА Новости | Дзен
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
- ПЦР-тест: что это, расшифровка анализа, как его делают
- Как часто сдавать ПЦР анализ на ЗППП если ничего не беспокоит?
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
Например, впервые ПЦР была использована таким образом для диагностики серповидно-клеточной анемии путем обнаружения мутации одного гена. Как проводится ПЦР-анализ Метод полимеразно-цепной реакции постоянно развивается. Самым распространенным на сегодня является тест в реальном времени, с помощью которого можно определить исходное количество копий ДНК РНК. ПЦР с вложенной парой праймеров гнездовая проводится в две стадии для снижения вероятности амплификации неспецифичных участков ДНК. Инвертированная ПЦР используется в случае, когда нужно выяснить природу неизвестных участков ДНК, окружающих известный. Это только часть методов ПЦР, количество которых постоянно пополняется новыми технологичными вариантами.
Для проведения анализа биоматериала с помощью ПЦР необходимо обеспечить его правильное взятие. При взятии мазка из носоглотки или ротоглотки образец биоматериала собирают путем введения длинного зонда-тампона в ноздрю или в заднюю часть горла. Во время анализа крови медицинский работник возьмет образец из вены на руке с помощью небольшой иглы. Количественный ПЦР в реальном времени позволяет также оценить инфекционную нагрузку, а также определить момент, когда условно-патогенные микроорганизмы стали патогенными в результате неконтролируемого роста. Список источников Mousa G.
Ghannam; Matthew Varacallo.
Поскольку любая молекула ДНК в водном растворе отрицательно заряжена, появляется возможность разделить смесь фрагментов ДНК различных размеров по их длине с помощью электрофореза. ДНК помещают в гель обычно, агарозный для относительно длинных и сильно отличающихся молекул или полиакриламидный для электрофореза с высоким разрешением , который помещают в постоянное электрическое поле. Из-за этого молекулы ДНК будут двигаться к положительному электроду аноду , причем их скорости будут зависеть от длины молекулы: чем она длиннее, тем сильнее ей мешает двигаться гель и, соответственно, тем ниже скорость. После электрофореза смеси фрагментов разных длин в геле образуют полосы, соответствующие фрагментам одной и той же длины. С помощью маркеров смесей фрагментов ДНК известных длин можно установить длину молекул в образце Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор, заключенный в канал из изолирующего материала начать пропускать электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент напряжения, то есть сформируется электрическое поле. Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении катода или анода, причем их трение об окружающую среду ограничивает скорость миграции. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса электрофореза.
Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала. В современных приборах рабочий канал заполняют гелем. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая гидрофильная пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы нуклеиновых кислот вообще не смогут «протиснуться» через поры геля и их миграция прекратится. В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели ПААГ и гели агарозы.
Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации рН буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. Но есть, разумеется, и свои проблемы. Разделяемые макромолекулы все же находятся в растворе, поэтому возможна их диффузия, приводящая к размыванию зон. Это тем более серьезно, что протекание через жидкость электрического тока неизбежно связано с выделением тепла. К счастью, крупные молекулы нуклеиновых кислот диффундируют не слишком быстро. Для визуализации результатов электрофореза проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют, а гель облучают ультрафиолетом, под действием которого связавшийся с двунитевой ДНК краситель флуоресцирует. А Электрофорез в полиакриламидном геле Рис.
Электрофорез в полиакриламидном геле чаще используется для белков Электрофорез в полиакриламидном геле ПААГ или PAGE - метод, широко используемый для разделения биологических макромолекул в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Подвижность является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Как и во всех формах гель-электрофореза, молекулы могут работать в своем естественном состоянии, сохраняя структуру молекул более высокого порядка, или может быть добавлен химический денатурант, чтобы удалить эту структуру и превратить молекулу в неструктурированную линейную цепь, подвижность которой зависит только от ее длины и отношение массы к заряду. Таким образом, разделяют т. Базовые приготовления Образцы могут представлять собой любой материал, содержащий белки. Они могут быть получены биологически, например, из прокариотических или эукариотических клеток, тканей, вирусов, проб окружающей среды или очищенных белков. Образец для анализа необязательно смешивают с химическим денатурантом, обычно SDS для белков. SDS - это анионный детергент, который денатурирует вторичные и недисульфидно-связанные третичные структуры и дополнительно придает отрицательный заряд каждому белку пропорционально его массе. Приготовление акриламидных гелей Гели обычно состоят из акриламида, бисакриламида, необязательного денатурирующего вещества SDS и буфера с отрегулированным pH. Раствор можно дегазировать под вакуумом, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха во время полимеризации.
Источник свободных радикалов и стабилизатор, такой как персульфат аммония и TEMED, добавляются для инициирования полимеризации. Реакция полимеризации создает гель из-за добавленного бисакриламида, который может образовывать поперечные связи между двумя молекулами полиакриламида. Гели, как правило, полимеризуются между двумя стеклянными пластинами в гелеобразователе, с гребнем, вставленным вверху для создания лунок для образца. После того, как гель полимеризован, «расческа» может быть удалена, и гель готов для электрофореза. Электрофорез В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и цели эксперимента. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или разными. Электрическое поле воздействует на гель, заставляя отрицательно заряженные белки мигрировать через гель от отрицательного электрода катода к положительному электроду аноду. В зависимости от их размера каждая биомолекула движется по-разному через матрицу геля: маленькие молекулы легче проникают через поры в геле, в то время как более крупные имеют большую сложность. Гель обычно работает в течение нескольких часов, хотя это зависит от напряжения, приложенного к гелю; Миграция происходит быстрее при более высоких напряжениях, но эти результаты обычно менее точны, чем при более низких напряжениях. По истечении заданного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера.
Меньшие биомолекулы движутся дальше вниз по гелю, в то время как более крупные остаются ближе к точке происхождения. Следовательно, биомолекулы могут быть разделены примерно в соответствии с размером, который зависит в основном от молекулярной массы в денатурирующих условиях, но также зависит от конформации высшего порядка в нативных условиях. После окрашивания биомолекулы разных видов появляются в виде отдельных полос внутри геля. Для калибровки геля и определения приблизительной молекулярной массы неизвестных биомолекул путем сравнения пройденного расстояния относительно маркера обычно используют маркеры размера молекулярной массы с известной молекулярной массой на отдельной дорожке в геле. Кроме «обычного» электрофореза в пластине из геля, в некоторых случаях используют капиллярный электрофорез, который проводят в очень тонкой трубочке, наполненной гелем обычно полиакриламидным. Разрешающая способность такого электрофореза значительно выше: с его помощью можно разделять молекулы ДНК, отличающиеся по длине всего на один нуклеотид. Об одном из важных приложений такого метода читайте в описании метода секвенирования ДНК по Сэнгеру. Элекрофорез в агарозном геле Самым популярным методом электрофореза с гелем является использование агарозного геля. Именно этот гель, как среду с определенным рН, используют в целях разделения, очищения и идентификации отдельных фрагментов ДНК. Почему эта методика стал столь популярна в современной генетике?
Гель электрофорез помогает выделить и разделить фрагменты дезоксирибонуклеиновой кислоты. За счет трений материалов, образующих гель, формируется «молекулярное сито», что помогает дифференцировать молекулы в соответствии с размером и зарядом. Скорость движения заряженных частиц ДНК через образованные поры в электрическом поле зависят от нескольких факторов: Силы образованного электрического поля; Относительной степени «боязни» воды образцов; Температурной кривой буфера и ионной силы. Рисунок 18. Электрофорез в агарозном геле с использованием бромистого этидия для визуализации результатов в ультрафиолете слева. Вторая слева дорожка-маркер с известными длинами фрагментов. Справа - Установка для проведения электрофореза в геле. Первый, наиболее часто используемый в последнее время - добавление в гель веществ флуоресцирующих, в присутствии ДНК традиционно использовался довольно токсичный бромистый этидий; в последнее время в обиход входят более безопасные вещества. Бромистый этидий светится оранжевым светом при облучении ультрафиолетом, причем при связывании с ДНК интенсивность свечения возрастает на несколько порядков. Другой метод заключается в использовании радиоактивных изотопов, которые необходимо предварительно включить в состав анализируемой ДНК.
В этом случае на гель сверху кладут фотопластинку, которая засвечивается над полосами ДНК за счет радиоактивного излучения этот метод визуализации называют авторадиографией Выявление определенной последовательности ДНК в смеси. Саузерн блоттинг Рис. Саузерн-блоттинг от англ. Southern blot — метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод Саузерн-блоттинга сочетает электрофорез в агарозном геле для фракционирования ДНК с методами переноса разделённой по длине ДНК на мембранный фильтр для гибридизации. С помощью электрофореза можно узнать размер молекул ДНК в растворе, однако он ничего не скажет о последовательности нуклеотидов в них. С помощью гибридизации ДНК можно понять, какая из полос содержит фрагмент со строго определенной последовательностью. Сначала необходимо синтезировать ДНК-зонд, комплементарный той последовательности, которую мы ищем. Он обычно представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 10—1000 нуклеотидов. Из-за комплементарности зонд свяжется с необходимой последовательностью, а за счет флуоресцентной метки или радиоизотопов, встроенных в зонд, результаты можно увидеть.
Для этого используют процедуру, называемую Саузерн-блоттинг или перенос по Саузерну, названную по имени ученого, ее изобретшего Edwin Southern. Первоначально смесь фрагментов ДНК разделяют с помощью электрофореза. На гель сверху кладут лист нитроцеллюлозы или нейлона, и разделенные фрагменты ДНК переносятся на него за счет блоттинга: гель лежит на губке в ванночке с раствором щелочи, который просачивается через гель и нитроцеллюлозу за счет капиллярного эффекта от бумажных полотенец, сложенных сверху. Во время просачивания щелочь вызывает денатурацию ДНК, и на поверхность пластины нитроцеллюлозы переносятся и закрепляются там уже одноцепочечные фрагменты. Лист нитроцеллюлозы аккуратно снимают с геля и обрабатывают радиоактивно меченной ДНК-пробой, специфичной к необходимой последовательности ДНК. Лист нитроцеллюлозы тщательно отмывают, чтобы на нем остались только те молекулы пробы, которые гибридизовались с ДНК на нитроцеллюлозе. После авторадиографии ДНК, с которой гибридизовался зонд, будет видна как полосы на фотопластинке рис. Схема проведения Саузерн-блоттинга Адаптация этой методики для определения специфических последовательностей РНК называется, в противоположность Саузерн-блоттингу, норзерн-блоттингом northern blotting : southern по-английски означает «южный», а northern — «северный». Денатурирующий градиентный гель-электрофорез DGGE Выше мы рассмотрели основные принципы работы гель-электрофореза. Однако все чаще в литературе, посвященной исследованиям по секвенированию ДНК, можно встретить информацию об использовании метода ДГЭ или денатурирующего градиентного гель-электрфореза.
В частности упоминается о т. Обнаружено, что определенные денатурирующие гели способны индуцировать расплавление ДНК на различных стадиях. В результате этого плавления ДНК распространяется по гелю и может быть проанализирована на отдельные компоненты, даже такие небольшие, как 200-700 пар оснований. Уникальность метода DGGE заключается в том, что по мере того, как ДНК подвергается все более экстремальным условиям денатурации, расплавленные нити полностью распадаются на отдельные нити. Процесс денатурации на денатурирующем геле очень резкий большинство фрагментов плавятся в пошаговом процессе. Дискретные части или домены фрагмента внезапно становятся одноцепочечными в очень узком диапазоне денатурирующих условий. Это позволяет различать различия в последовательностях ДНК или мутации различных генов: различия в последовательности фрагментов одинаковой длины часто приводят к тому, что они частично плавятся в разных положениях градиента и поэтому "останавливаются" в разных положениях геля. На чем основан метод DGGE? Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза основан на зависимости свойств плавления или денатурации небольших двухнитевых молекул ДНК от их нуклеотидной последовательности, а точнее - от соотношения А-Т- и G-C-пар в исследуемых фрагментах. Объясняется это тем, что G-C-связь более прочна по сравнению со связью между нуклеотидами А и Т.
Подобные различия в динамике плавления могут быть выявлены путем сравнения подвижности нормальных и мутантных двухнитевых фрагментов ДНК при их электрофорезе в денатурирующих условиях.
При использовании специально разработанных приборов для ПЦР цикл амплификации занимает всего несколько минут. Таким образом, в течение нескольких часов могут быть получены миллиарды копий стартовой молекулы ДНК. ПЦР может генерировать достаточные для анализа мутаций количества специфических генов из образцов ДНК. Конкретные части генов обычно экзоны быстро амплифицируются с помощью специфичных праймеров.
Амплифицированный сегмент затем может или быть легко секвенирован, или протестирован методом АСО-гибридизации для обнаружения мутации. Анализ ДНК, генерируемой в ходе ПЦР, может быть выполнен менее чем за один день, существенно облегчая разработку и клиническое использование большого числа диагностических ДНК-тестов. Сначала, с помощью того же фермента обратной транскриптазы, которую используют для изготовления библиотек клонов кДНК, на основе интересующей мРНК синтезируется однонитевая кДНК.
Орадова А. Разумовская И. Нанотехнология: учеб.
Элективный курс. Ребриков Д. ПЦР «в реальном времени». Лаборатория знаний, 2009. Vysotin S. Polymerase chain reaction as a method of laboratory diagnosis of tuberculosis in HIV-infected.
Gilmiyarova F. Polymerase chain reaction. Discovery history. A new stage of development. Lopukhov L. Polymerase chain reaction in clinical microbiological diagnostics.
Nesterov S.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
читайте в нашей статье. ПЦР анализ на инфекции Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить у человека различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии. Отличия ПЦР-диагностики от других методов лабораторного исследования заключаются в следующем. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом. ПЦР диагностика является быстрым и точным методом исследования, когда невозможно вывить возбудителя другими методами. Согласно руководству ВОЗ, анализы на коронавирус COVID-19 должны проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией.