Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
Анализ ПЦР: суть метода и его преимущества
ИФА сформирован на избирательном отклике специфических иммунологических взаимодействий между антигеном и антителом. Установление образовавшегося комплекса антиген-антитело выполняют с использованием особого фермента, который служит в качестве метки, регистрирующей сигнал взаимодействия. Преимущества ИФА при диагностике патологических процессов: Специфичность иммуноферментного анализа на высоком уровне. Достаточная простота и чувствительность метода ИФА. Высокая каталитическая активность, способствующая выявлению метки во время реакции антиген-антитело при минимальной концентрации возбудителя.
Стабильность при образовании комплексов антиген-антитело. Процесс «узнавания» анализируемого комплекса чувствительным к нему иммуноглобулином осуществляется в количественном соответствии. Используется два подхода для количественной оценки анализируемых иммунных комплексов. Первая — это определение концентрации образовавшихся иммунных комплексов.
А вторая — измерение концентрации не вступивших в реакцию антител. Иммунологический метод диагностики нацелен на обнаружение иммуноглобулинов трех классов: Антитела ИГ М. Антитела ИГ А.
Преимущества ИФА при диагностике патологических процессов: Специфичность иммуноферментного анализа на высоком уровне.
Достаточная простота и чувствительность метода ИФА. Высокая каталитическая активность, способствующая выявлению метки во время реакции антиген-антитело при минимальной концентрации возбудителя. Стабильность при образовании комплексов антиген-антитело. Процесс «узнавания» анализируемого комплекса чувствительным к нему иммуноглобулином осуществляется в количественном соответствии.
Используется два подхода для количественной оценки анализируемых иммунных комплексов. Первая — это определение концентрации образовавшихся иммунных комплексов. А вторая — измерение концентрации не вступивших в реакцию антител. Иммунологический метод диагностики нацелен на обнаружение иммуноглобулинов трех классов: Антитела ИГ М.
Антитела ИГ А. Антитела ИГ G. Сначала в организме человека в течение первых 10—15 суток появляются иммуноглобулины типа М.
ПЦР-исследование — это достижение и огромная заслуга молекулярной биологии. Это — метод, который, обнаружив микроучастки ДНК или РНК чужеродного генетического материала генома , способен распознать индивидуальные характеристики, присущие только одному виду микроорганизмов, не спутав его ни с каким другим. Как же работает метод ПЦР и как ему удается восстановить картину поведения инфекционной клетки в живом организме? Однако для дальнейшего процесса необходимо большое количество таких микроучастков, что может обеспечить его размножение путем достраивания новых, идентичных найденному фрагменту, участков ДНК репликация. Размножение является естественным и неотъемлемым свойством нуклеиновой кислоты, которая будет реплицироваться с помощью фермента полимеразы даже вне живого организма в пробирке с пробой , образуя множество клонов, то есть, пойдет цепная реакция. Клонироваться будут все новые и новые фрагменты, но только те, в которых заинтересован исследователь. Вот почему так важно взять «чистый», без посторонних примесей анализ, а тест проводить очень аккуратно. Учитывая перечисленные способности полимеразной цепной реакции, можно догадаться, почему она так легко отличает уреаплазму от микоплазмы , или каждую из них от хламидии. Таким образом, даже если среди миллионов клеток человеческого организма затеряется не сам живой вирус, а лишь частица его ДНК, то ПЦР, если ей ничто не помешает, пожалуй, справится с задачей и сообщит о пребывании «чужака» положительным результатом. В этом суть ПЦР и ее основное достоинство. Достоинства и недостатки К лаборатории, осуществляющей ПЦР-диагностику, предъявляются высочайшие требования в плане оборудования, тест-систем и квалификации медицинского персонала. Это высокотехнологичная лаборатория, располагающая арсеналом высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов, поэтому особых недостатков она не имеет.
Если в пробе РНК коронавируса его не обнаружили, то это означает, что на момент взятия мазка пациент не инфицирован. Метод ПЦР отличается более высокой чувствительностью, чем экспресс-тест, и информативен для выявления всех известных штаммов коронавируса, включая «омикрон». В редких случаях пациенты с симптомами COVID-19 или его бессимптомные носители могут получить отрицательный результат теста. Это возможно при низкой вирусной нагрузке слишком малое количество вируса в верхних дыхательных путях , поздних стадиях заболевания, когда у пациента уже поражены лёгкие вирус «спустился» из носоглотки в лёгкие , и при неправильном взятии мазка. Такое бывает, когда мазок берут со слизистой носовых ходов и ротовой полости, а не из носоглотки и ротоглотки.
Что такое ПЦР
Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл. • При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе.
ПЦР-исследования
За 3 часа до исследования рекомендуется отказаться от курения, употребления пищи и гигиены полости рта полоскание, чистка зубов, применение освежителей для рта, употребление леденцов, жевательной резинки. Подготовка к ПЦР-анализу мокроты За 2 недели до исследования по согласованию с лечащим врачом следует прекратить приём противомикробных препаратов и иммуномодуляторов. Мокроту следует собирать утром, сразу после пробуждения. Предварительно нужно почистить зубы и прополоскать рот, нельзя есть до взятия биоматериала. Важно собирать не слюну или носоглоточную слизь, а мокроту. Сделайте несколько глубоких вдохов, чтобы вызвать «мокрый» кашель. Необходимо откашлять содержимое глубоких дыхательных путей. Сплюньте мокроту в заранее подготовленный стерильный контейнер с плотно закрывающейся крышкой. Минимальный объём мокроты — 1 мл.
Доставьте контейнер в лабораторное отделение в день взятия биоматериала. Подготовка к соскобу из зева За 24 часа до исследования по предварительному согласованию с лечащим врачом следует отказаться от терапии полости рта какими-либо лекарственными препаратами. Подготовка к соскобу из влагалища или урогенитального тракта За 30 дней до исследования следует прекратить применение антибиотиков по согласованию с лечащим врачом. За 24 часа до исследования не следует проводить спринцевание, внутривагинальную терапию свечи, тампоны , не использовать антисептические средства в том числе мирамистин , исключить половой контакт.
Этапы ПЦР-диагностики. Ложные результаты могут дать нарушения на любом из этапов исследования ПЦР-диагностика инфекций относится к категории «золотых стандартов» среди других лабораторных методов, поэтому ее можно применить для поиска возбудителей многих заболеваний, на первый взгляд не имеющих ничего общего между собой: Туберкулез различной локализации, пневмония в том числе и атипичная, вызванная хламидией ; Детские инфекции коревая краснуха, паротит, корь ; Дифтерия; Зоонозная инфекционная болезнь — листериоз заболевание характеризуется многообразием симптомов с поражением лимфоузлов, ЦНС, внутренних органов ; Заболевания, обусловленные проникновением вируса Эпштейн-Барра инфекционный мононуклеоз и др. Доказано, что хеликобактер становится причиной развития рака желудка или 12-перстной кишки; Кандидоз и практически все ЗППП. ПЦР-диагностика инфекций, передающихся половым путем, имеет особую значимость, поскольку заболевания, вызванные таким образом, часто длительное время протекают без каких бы то ни было клинических проявлений, зато при беременности начинают активизироваться и, таким образом, угрожать здоровью и даже жизни ребенка.
Некоторые из них «торч» относятся одновременно и к ИППП, поэтому последние требуют более подробного рассмотрения. Ознакомиться с самыми популярными методиками читатель сможет в следующих разделах статьи. Как правильно подготовиться, чтобы получить достоверный результат? Сразу заметим, что подготовка к ПЦР довольно простая, никаких особых усилий со стороны пациента не требующая. Нужно лишь выполнить три несложных задания: Не иметь половых контактов за 24 часа до того, как сдать анализ; Для забора и анализа крови из вены нужно прийти на голодный желудок, пить, кстати, тоже нельзя; Сдать мочу следует ночную утром — в стерильную баночку, приобретенную накануне в аптеке. ПЦР может работать в любой биологической среде Метод ПЦР не отличается «кровожадностью», поэтому приемлет любую биологическую среду, содержащую предполагаемый инфекционный агент. Обычно выбор — что нужно взять для исследования, остается за врачом. Таким образом, в поисках возбудителя, кроме анализа крови хотя он тоже подходит и в большинстве случаях берется параллельно другому материалу , можно использовать: Мазок выделения урогенитального тракта ; Соскоб слизистых ротовой полости, конъюнктивы, носоглотки, половых путей у женщин берут из шейки матки и влагалища, у мужчин — из уретры ; Слюну;.
Зимой, как только первый геном был опубликован, специалисты во всех странах начали заказывать синтез генетического материала nCoV-19. Зная нуклеотидную последовательность генома, в лаборатории можно получить участок этого генома и дальше экспериментировать уже с ним. В частности, проверить чувствительность и специфичность теста, используя вместо клинических образцов растворы ДНК. В январе у ученых большинства стран вообще и не было другого выхода, настоящие пациенты имелись только в Китае. К такому методу могут быть претензии. Например, если чувствительность теста проверяется по растворам кДНК, не учитываются потери при обратной транскрипции. Тут разные другие тонкости. Но в целом ученые сработали очень оперативно. ПЦР полимеразная цепная реакция — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом. Он основан на многократном копировании амплификации определенных участков вирусной ДНК в лабораторных условиях.
По факту, чтобы «засечь» вирус в организме, с помощью специального фермента, собирающего из нуклеотидов по образцу вирусной ДНК ее копию, ученые дублируют фрагменты генетического материала вируса, пока их число не станет настолько большим, что будет возможно зафиксировать его присутствие с помощью флуоресцентных меток. Как это работает? Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК. РНК-праймер изображен белым прямоугольником в начале каждой из двух цепей Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают. На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный. По завершении реакции цикл неоднократно повторяется см.
Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин. Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации загрязнения материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР. Словарь ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота - биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку. Процесс этот называется транскрипцией. Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка. Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК. Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу. Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию - адениновый A , содержащий аденин, гуаниновый G - гуанин, цитозиновый C - цитозин, тиминовый Т - тимин, урациловый U - урацил. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.
ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
Когда проводится анализ? ПЦР получила широкое распространение в различных областях практической медицины. Исследование является одним из основных методов диагностики различных инфекционных заболеваний с половым путем передачи. К ним относятся патологические процессы, вызванные: вирусами герпетическая, папилломавирусная инфекция , ВИЧ СПИД, вирусные гепатиты с парентеральным путем передачи специфическими бактериями сифилис, гонорея, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз простейшими трихомониаз Полимеразная цепная реакция также может использоваться для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенными грибами кандидоз. Какой материал исследуется?
Rebrikov D. Knowledge Laboratory, 2009. Традиционные методы лабораторной диагностики инфекций базируются на таких классических методах микробиологии, как микроскопия, культуральное исследование, а также на серологической диагностике — радиоиммунном, иммуноферментном, иммунофлюоресцентном анализе, реакции прямой и непрямой гемагглютинации, реакции преципитации и связывания комплемента. Но у этих методов есть свои недостатки — большая длительность и трудоемкость проведения анализа, необходимость специальной подготовки персонала, а также достаточно высокая стоимость. Молекулярная биология на современном этапе располагает широким спектром новейших методик, направленных на возможность выявления антигенов, ферментов, токсинов и нуклеиновых кислот возбудителя ДНК И РНК. Ведущую роль среди них занимают методы исследований, направленные на обнаружение генетического материала возбудителей инфекций. Использование наночастиц позволяет определить присутствие инфекционных агентов в малом объеме пробы напрямую, а также дает возможность проведения современной мультиплексной диагностики в максимально сжатый срок. На сегодняшний день генодиагностика занимает одно из ведущих мест среди других методов клинической лабораторной диагностики. Оптимальным для проведения рутинных анализов считается полимеразная цепная реакция ПЦР , которая представляет собой осуществляемую в условиях in vitro специфическую амплификацию накопление нуклеиновых кислот с использованием синтетических праймеров. Методика исследования материала с использованием принципа полимеразной цепной реакции была разработана американским ученым Кэри Мюллисом в 1983 г. Перед ним стояла задача создания метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с добавлением фермента ДНК-полимеразы. Спустя несколько лет после обнародования своего открытия, в 1993 г. Изначально метод диагностики был запатентован компанией «Цетус Корпорейшн», в которой и работал его создатель. Но в 1992 г. В России метод полимеразной цепной реакции был внедрен и начал использоваться в 1995 г. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике инфекционных заболеваний.
Недостаточно, чтобы антитела были просто выявлены. Нужно смотреть и на их комбинацию. Сдать такой анализ нужно, чтобы узнать, вырабатывает ли организм антитела к вирусу, а если да, то сколько. Тесты на антитела Разные виды тестов на антитела к коронавирусу проводятся дома или в лаборатории. В лаборатории берут кровь из вены и выполняют количественную оценку вырабатываемых иммуноглобулинов. Домашний тест покажет, есть ли антитела в принципе. Сколько их вырабатывается, с его помощью узнать нельзя: для этого требуются познания в биохимии и специальное оборудование для подсчета. В этом случае достаточно капиллярной крови из пальца. Проколоть себе палец может не каждый, поэтому стоит прибегнуть к помощи близких или вызвать медсестру. Анализ сдают натощак. Поесть можно максимум за 12 часов до забора крови. Диагностику следует отложить при повышении температуры. Что показывает тест на антитела? Наличие иммуноглобулинов означает, что пациент либо болеет сейчас, либо переболел коронавирусом недавно. Если антитела отсутствуют, он либо не заражался никогда, либо микроорганизм попал в тело совсем недавно. Иммунный ответ формируется до двух недель. Данное исследование не стоит воспринимать как пробу на коронавирус. Если антитела к нему есть, значит, контакт с возбудителем был. Но их отсутствие нельзя однозначно трактовать как избегание вируса. Наличие антител и прививки Положительный результат описанного исследования еще не гарантирует невозможность повторного заражения. Иммунитет формируется ориентировочно на полгода. Поэтому в регионах, где установлены ограничения, QR-коды выдаются не только привитым, но и переболевшим в течение последних шести месяцев.
Для уточнения диагноза лучше сделать ПЦР-тест. Анализ на антитела к коронавирусу Анализ на антитела к коронавирусу показывает не присутствие инфекции в организме, а ответ иммунной системы на нее. В ответ на заражение она вырабатывает несколько типов иммуноглобулинов: IgA являются реакцией непосредственно на коронавирус; IgM синтезируются при наличии инфекции в организме указывают на острое течение заболевания ; IgG появляются, когда тело «запоминает» вирус и формирует иммунитет к нему. Недостаточно, чтобы антитела были просто выявлены. Нужно смотреть и на их комбинацию. Сдать такой анализ нужно, чтобы узнать, вырабатывает ли организм антитела к вирусу, а если да, то сколько. Тесты на антитела Разные виды тестов на антитела к коронавирусу проводятся дома или в лаборатории. В лаборатории берут кровь из вены и выполняют количественную оценку вырабатываемых иммуноглобулинов. Домашний тест покажет, есть ли антитела в принципе. Сколько их вырабатывается, с его помощью узнать нельзя: для этого требуются познания в биохимии и специальное оборудование для подсчета. В этом случае достаточно капиллярной крови из пальца. Проколоть себе палец может не каждый, поэтому стоит прибегнуть к помощи близких или вызвать медсестру. Анализ сдают натощак. Поесть можно максимум за 12 часов до забора крови. Диагностику следует отложить при повышении температуры. Что показывает тест на антитела? Наличие иммуноглобулинов означает, что пациент либо болеет сейчас, либо переболел коронавирусом недавно. Если антитела отсутствуют, он либо не заражался никогда, либо микроорганизм попал в тело совсем недавно. Иммунный ответ формируется до двух недель. Данное исследование не стоит воспринимать как пробу на коронавирус. Если антитела к нему есть, значит, контакт с возбудителем был. Но их отсутствие нельзя однозначно трактовать как избегание вируса.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале (пробе). Встречаемость Enterococcus spp и генов обуславливающих резистентность, при анализе методом ПЦР в реальном времени. Преимущества метода ПЦР над иммуноферментным анализом и прочими иммунологическими инструментами выявления инфекции заключается в том, что он реже дает ошибочные результаты.
Достоверность метода ПЦР
Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладает высокой специфичностью при выявлении РНК SARS-CoV-2. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация (то есть многократное увеличение) фрагментов ДНК в биоматериале. • При необходимости исследования единого первичного образца разными диагностическими методами первая аликвота должна отбираться для ПЦР‐анализа наконечником с фильтром. В качестве материала для исследований методом полимеразной цепной реакции выступают кровь, моча, слюна, мокрота, ликвор, биоптаты тканей, соскобы со слизистых оболочек.
ПЦР анализ: что это такое? На какие 12 инфекций сдается?
Тем не менее, существует определенный перечень материалов, которые покажут наиболее точные результаты. Соскобы со слизистых оболочек чаще всего уретры, влагалища, шейки матки. Их исследуют, главным образом, для диагностики половых инфекций. Таким способом во взятом мазке можно обнаружить возбудителей уреаплазменной и микоплазменной инфекций, гонококки, хламидии, трихомонады, гарднереллы, грибки рода Candida, вирус генитального герпеса и др. Ее можно использовать в диагностике урогенитальных инфекций. ПЦР анализ мочи является альтернативой исследованию мазка из уретры для мужчин. Это особенно подходит тем пациентам, которые боятся болезненного взятия уретрального мазка. Бронхиальная слизь. Может исследоваться с целью диагностики респираторных форм хламидийной и микоплазменной инфекций. Анализ крови ПЦР — это один из самых точных способов выявления в организме некоторых патогенных вирусов. Такое исследование позволяет диагностировать:.
Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции. Инвертированная ПЦР [en] inverse PCR — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов лигирование. В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берётся в большом избытке. ПЦР проводят при высокой температуре отжига, тем самым удаётся поддержать эффективности реакции на протяжении всех циклов [18].
В этом методе используют флуоресцентно меченые ДНК-зонды для анализа накопления продукта реакции или интеркалирующий краситель SYBR Green или его аналоги. Sybr Green I [en] обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной.
Обследоваться на ЗППП можно хоть каждый день — по желанию.
Все зависит от наличия свободного времени, денег и уровня вашей тревожности. Есть только один нюанс. Метод ПЦР — очень точный анализ. С его помощью можно обнаружить в недрах организма считанные копии вируса или бактерии. И ни один честный врач не скажет вам наверняка, насколько эта находка опасна для здоровья, и каков достоверный риск осложнений.
Поэтому решите для себя заранее, сможете ли вы спокойно жить дальше или будете лечить результаты анализа даже в тех случаях, когда до похода в клинику у вас не было никаких проблем с интимным здоровьем. Иначе обстоят дела с обследованием на ЗППП в группе риска — у людей с рискованным сексуальным поведением и беременных женщин. Им необходимо периодически сдавать анализы на половые инфекции, даже если нет никаких жалоб на здоровье. Сексуальным экстремалам профилактическое обследование нужно, чтобы выявить факт инфицирования еще до появления симптомов и как можно раньше принять меры для защиты своих половых партнеров от заражения. Беременным женщинам диагностика ЗППП необходима, потому что многие мамины инфекции передаются будущему малышу.
Даже если нет симптомов у женщины, последствия для ребенка могут быть тяжелыми. Согласно принятым государственным программам как в нашей стране , так и в США , профилактическая диагностика скрининг на ЗППП проводится только среди людей с рискованным сексуальным поведением и у беременных женщин. Скрининг на герпес и ВПЧ не проводят даже в группе риска. Для остальных людей при отсутствии жалоб и клинических проявлений обследование на ЗППП вообще не рекомендуется. Забор материала — дело нескольких минут.
Врач делает это с помощью стерильного зонда в виде ватной палочки, щетки, «ершика» или специальной ложки. Источник: hemltd. По настоящему скрытые инфекции — это редкость. Гораздо чаще встречаются не скрытые, а забытые инфекции: когда вроде что-то было, но само прошло, хотя инфекция никуда не делась, а только перешла в вялотекущую форму. Дело в том, что многие половые инфекции имеют волнообразное течение.
Другие клетки —иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезировать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти клетки существуют лишь несколько дней. Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует признаки обоих «родителей». К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, несколько тысяч гибридом, в т. Преимущества МАТ: Главная особенность МАТ — чрезвычайная моноспецифичность против одной антигенной детерминанты и абсолютная однородность.
Возможность многократного получения в течение длительного времени воспроизводимость. Неограниченное количество получаемых антител. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы. Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты. Метод ИФА находится в постоянном развитии. С одной стороны, расширяется число объектов исследования, с другой - углубляются и совершенствуются методы самого анализа.
Это приводит к тому, что упрощается схема анализа, сокращается время его проведения, уменьшается расход реагентов. Идет постоянный поиск все новых и новых веществ, используемых в качестве маркеров. Все возрастающее влияние на ИФА оказывают химия высокомолекулярных соединений, клеточная и генная инженерия, под влиянием которых меняются технологии получения реагентов для ИФА. Еще одним из важнейших современных методов диагностики заболеваний внутренних органов является ДНК-диагностика методом полимеразной цепной реакции. ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его. ПЦР — это циклический процесс, в каждом цикле которого происходит тепловая денатурация двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение коротких олигонуклеотидов-праймеров и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы путем присоединения нуклеотидов.
В результате накапливается большое количество копии исходной ДНК-мишени, которые легко подаются детекции. Открытию полимеразной цепной реакции сопутствовало развитие молекулярно-биологических технологий. Первые данные о химических своиствах ДНК появились в 1868 г. К началу 50-годов ХХ в. Основания бывают двух типов: пуриновые — аденин и гуанин и пиримидиновые — цитозин и тимин. В 1953 г.
Уотсон и Ф. Крик пришли к выводу, что нативная ДНК состоит из двух комплиментарных полимерных цепей, образующих двойную спираль. Согласно модели Уотсона навитые одна на другую цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, а гуанин — с цитозином. Каждая цепь служит матрицей при синтезе новой цепи, а последовательность в синтезируемой растущей цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы. В 1955 г.
В чем суть полимеразной цепной реакции?
- Что такое анализ ПЦР?
- Рибосомальная 16S РНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование биополимеров
- Что выявляет анализ ПЦР
- Запланируйте визит в наш центр
Тесты ПЦР при коронавирусе
- Что такое анализ ПЦР?
- СВЯЗАТЬСЯ С РЕДАКЦИЕЙ
- Метод анализа ПЦР: суть и преимущества | Подготовка и проведение анализа ПЦР
- Чем отличается диагностика ПЦР от ИФА
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Особенности
- Преимущества и недостатки
Характеристика метода ПЦР
- ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
- На чем основана диагностика при помощи ИФА
- Актуальные методы диагностики COVID-19
- Рибосомальная 16S РНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование биополимеров
- Методы диагностики ВИЧ-инфекции: сроки и достоверность исследований
- Что такое ПЦР
ПЦР-диагностика
Совсем недавно ПЦР использовали как последнюю надежду, когда с помощью других диагностических процедур подтвердить или исключить диагноз не получалось — методам не хватало чувствительности. Сейчас ПЦР-диагностику освоили во многих крупных лабораториях и продвигают её в качестве коммерческого метода, доступного каждому, кто хочет обследоваться. Обычно предлагают готовые наборы анализов: ПЦР на 3-5-7-14-16 и другое количество инфекций, передающихся половым путем. Нередко анализ навязывают тогда, когда обследоваться совсем не обязательно или можно обойтись более дешевой диагностикой без потери качества. Давайте разберемся, когда нужно искать половые инфекции и когда это необходимо делать именно методом ПЦР. Обследоваться на ЗППП можно хоть каждый день — по желанию.
Все зависит от наличия свободного времени, денег и уровня вашей тревожности. Есть только один нюанс. Метод ПЦР — очень точный анализ. С его помощью можно обнаружить в недрах организма считанные копии вируса или бактерии. И ни один честный врач не скажет вам наверняка, насколько эта находка опасна для здоровья, и каков достоверный риск осложнений.
Поэтому решите для себя заранее, сможете ли вы спокойно жить дальше или будете лечить результаты анализа даже в тех случаях, когда до похода в клинику у вас не было никаких проблем с интимным здоровьем. Иначе обстоят дела с обследованием на ЗППП в группе риска — у людей с рискованным сексуальным поведением и беременных женщин. Им необходимо периодически сдавать анализы на половые инфекции, даже если нет никаких жалоб на здоровье. Сексуальным экстремалам профилактическое обследование нужно, чтобы выявить факт инфицирования еще до появления симптомов и как можно раньше принять меры для защиты своих половых партнеров от заражения. Беременным женщинам диагностика ЗППП необходима, потому что многие мамины инфекции передаются будущему малышу.
Даже если нет симптомов у женщины, последствия для ребенка могут быть тяжелыми. Согласно принятым государственным программам как в нашей стране , так и в США , профилактическая диагностика скрининг на ЗППП проводится только среди людей с рискованным сексуальным поведением и у беременных женщин. Скрининг на герпес и ВПЧ не проводят даже в группе риска. Для остальных людей при отсутствии жалоб и клинических проявлений обследование на ЗППП вообще не рекомендуется. Забор материала — дело нескольких минут.
ПЦР может генерировать достаточные для анализа мутаций количества специфических генов из образцов ДНК. Конкретные части генов обычно экзоны быстро амплифицируются с помощью специфичных праймеров. Амплифицированный сегмент затем может или быть легко секвенирован, или протестирован методом АСО-гибридизации для обнаружения мутации. Анализ ДНК, генерируемой в ходе ПЦР, может быть выполнен менее чем за один день, существенно облегчая разработку и клиническое использование большого числа диагностических ДНК-тестов. Сначала, с помощью того же фермента обратной транскриптазы, которую используют для изготовления библиотек клонов кДНК, на основе интересующей мРНК синтезируется однонитевая кДНК.
Один из олигонуклеотидов запускает синтез второй нити кДНК, полученная двойная спираль затем служит в качестве объекта ПЦР. ПЦР, по сравнению с любым другим методом анализа, чрезвычайно чувствительная, более быстрая, менее дорогая и нетребовательная к образцам пациентов методика.
Суть ПЦР состоит в многократном «клонировании» находящихся в исследуемом материале фрагментов ДНК инфекционного агента. ПЦР диагностика инфекций считается наиболее быстрым, современным методом. ПЦР диагностику используют повсеместно.
Все ведущие клиники используют диагностику ПЦР для верификации инфекционных заболеваний. Часто пациенты спрашивают, какие именно заболевания можно выявить при помощи метода ПЦР диагностики? Диагностика методом ПЦР используется для выявления широкого спектра возбудителей. Как делают ПЦР анализ? Такое исследование проводится одинаково для диагностики любого заболевания.
Разница может быть лишь в исследуемом субстрате. Для этого пробирку с биоматериалом помещают в реактор, где с помощью катализаторов происходит процесс копирования молекул ДНК возбудителя инфекции. Метод ПЦР очень быстрый и простой. В качестве результата, вы получаете заключение врача лаборанта.
Она включает ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и осаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК, однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.
Одним из наиболее популярных является метод выделения ДНК, предложенный R. После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР, поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.
Следует отметить, что из-за большого числа стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, поскольку возможна перекрестная контаминация между пробами и образующимся аэрозолем ДНК. При классической процедуре фенольно-хлороформной экстракции ДНК достигается хорошая очистка ДНК, в первую очередь от ингибиторов Tag-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex США , которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом.
К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца. При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, возможно использование простых способов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время использование подобных методов для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам вследствие применения в реакционной смеси некачественного препарата ДНК. Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.
Во время следующей процедуры - амплификации - образец, содержащий ДНК возбудителя, вносится в небольшую пробирку с компонентами, обеспечивающими протекание полимеразной реакции, два вида праймеров, два энзима Таg-полимераза и N-урацил-гликолаза и четыре вида нуклеотида A, Г, Ц, У. Для проведения полимеразной реакции используется специальное устройство термоциклер или ДНК-амплификатор , позволяющее автоматически, по определенной программе изменять температурный режим реакционной смеси. Весь цикл с изменением температуры продолжается менее 3 минут. Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что данный метод не является количественным. Теоретически продукты амплификации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помощью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это выполняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к идеальным, что встречается нечасто.
Особенно большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, то есть наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенный на сегодняшний день - электрофорез, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Застывшая агароза образует пространственную решетку.
При заливке с помощью гребенок в геле формируют специальные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации. Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияют концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью.
Краситель встраивается интеркалирует плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 минут до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне 254 - 310 нм. Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной области видимого спектра 590 нм. В качестве «положительного контроля» используют стандарт ДНК искомого микроорганизма. Размер неспецифических ампликонов может быть как больше, так и меньше по сравнению с «положительным контролем». В худшем случае эти размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.
В то же время препарат ДНК, подготовленный для ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Необходимо контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью, для чего используют дополнительный, так называемый «внутренний контроль», который представляет собой любой стандарт ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда, например, используют р-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций пришивают участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. Если «внутренний контроль» внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и хромосомальная ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он был в 2 и более раз больше, чем ампликоны, образуемые от амплификации искомой ДНК микроорганизма. В результате, если внести ДНК «внутреннего контроля» в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то, независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, «внутренний контроль» станет причиной образования специфических ампликонов, но значительно более длинных тяжелых , чем ампликон микроорганизма.
Наличие тяжелых ампликонов в реакционной смеси свидетельствует о нормальном прохождении реакции амплификации и отсутствии ингибиторов. Если ампликоны нужного размера и «внутреннего контроля» не образовались, можно сделать вывод о наличии в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, но не об отсутствии искомой ДНК.
Сколько стоит сдать ПЦР-анализ
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии. В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Анализ — полимеразная цепная реакция имеет аббревиатуру — ПЦР. Чтобы это сделать, мы разрабатываем ПЦР-тест, который будет «смотреть» конкретно этот вариант из всего генома, есть он у человека или нет. 40. Исследование биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени: Методиче-ское пособие для лаборантов / Сост.