ПЦР-тестирование (полимеразная цепная реакция) направлено на выделение РНК вируса, а не на сбор ДНК. ПЦР в реальном времени (реал-тайм): методика и преимущества (д.б.н. Ю.М. Романова, ч. 2). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод молекулярной биологии, позволяющий увеличить изначально низкую концентрацию заданной последовательности ДНК в растворе так, что ее присутствие становится детектируемым визуально. Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР также можно выполнять как количественный анализ для измерения объема конкретной последовательности ДНК в образце.
ПЦР: простыми словами о принципе работы, применении и новых технологиях
Метод ПЦР в реальном времени может быть использован для быстрого и эффективного анализа однонуклеотидных полиморфизмов, связанных с развитием миомы матки. ПЦР – полимеразная цепная реакция. ПЦР (полимеразная цепная реакция) – это метод, используемый в биохимии и молекулярной биологии для увеличения количества определенного фрагмента ДНК. Что такое полимеразная цепная реакция (ПЦР)?
ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
Частички еды могут извратить результат. Достаточно прополоскать рот с водой и идти на анализ», — пояснил специалист. Отвар овса лечит бронхиальную астму Перед мазком также не рекомендуется пить кофе, чай, иные напитки, чистить зубы, полоскать рот освежающими смесями, жевать жевательную резинку, курить. Нос нельзя промывать, закапывать туда капли или мазать лекарствами. Если берут кровь, то ее необходимо сдавать натощак, чтобы результат был максимально точным. Мочу следует собирать в утреннее время суток натощак или через 2-3 часа после приема пищи. Желательно сделать это сразу после сна. Расшифровка анализа ПЦР После проведения теста результаты оцениваются и аппаратурой, и специалистами-медиками. В анализе будет либо да, либо нет. Самому человеку ничего расшифровывать не нужно, единственное, что специалист может посмотреть за машиной — это количество кусочков РНК, потому что бывают ложноположительные или ложноотрицательные результаты, если в аппарате произошел сбой.
Все равно контроль со стороны врача присутствует». Там ничего нового сделать нельзя. Набор частичек увеличивается до того количества, которое может распознать машина. Сделать это можно, даже если частиц очень мало», — отметил Андрей Кондрахин. При этом из-за того, что зачастую встречаются ошибки при взятии биологического материала и существует вероятность попадания инородных частичек, могут возникать ложноположительные или ложноотрицательные результаты тестирования на коронавирус. Что такое анализ ПЦР? ПЦР полимеразная цепная реакция — это молекулярно-биологический метод, в основе которого лежит амплификация то есть многократное увеличение фрагментов ДНК в биоматериале. Метод ПЦР применяется во многих сферах деятельности, в том числе в качестве быстрого и высокоточного способа диагностики определенных инфекционных и генетических заболеваний человека, а также для выявления спонтанных или унаследованных изменений в ДНК, исследованиях генома сельскохозяйственных растений и животных для селекционных и других задач, в криминалистике, археологии, установлении отцовства, клонировании и секвенировании геномов и прочих сферах деятельности человека. Вирусы, бактерии и грибы — основные человеческие патогены — содержат ДНК или РНК, причем для каждого вида последовательность нуклеотидов уникальна.
Короткие фрагменты, комплементарные целевым участкам нуклеотидов каждого возбудителя, называются праймерами. В основе анализа на ПЦР лежит создание большего числа копий генетического материала ДНК или РНК с помощью этих самых праймеров и специальных ферментов посредством серии циклов нагрева и охлаждения. Полученные амплифицированные сегменты далее методом гель-электрофореза или с помощью другой технологии сравниваются с другими нуклеотидными сегментами из известного источника например, патогенного микроорганизма для определения их идентичности. Это один из основных методов обнаружения бактерий или вирусов на молекулярном уровне, с более высокой степенью точности, чем микроскопические или бактериологические исследования, и значительно более быстрый, чем метод культивирования. Это также единственный способ определить наличие генетических вариаций, указывающих на предрасположенность к онкологическим и другим заболеваниям. Чувствительность диагностических инструментов для выявления мутаций онкогенов и генов подавления опухоли была улучшена по крайней мере в десять тысяч раз благодаря ПЦР, что позволяет раньше диагностировать, например, такие виды рака, как лейкемия. Метод ПЦР также позволил разработать индивидуальную терапию для больных раком.
Несмотря на усталость, той ночью Муллис не сомкнул глаз.
За уикэнд он разрисовал схемами своей полимеразной цепной реакции всю бумагу на даче. Дженнифер не отвлекала его, потому что поставила себе цель успеть как следует загореть на пруду. Изобрёл принцип циклического клонирования in vitro, назвал процесс полимеразной цепной реакции ПЦР , тиражирование генетического материала — амплификацией, а программируемый прибор для его проведения — амплификатором. Фото сделано в 1991 году после присуждения премии канадского фонда Гэрднера. За рулём такой машины майской ночью 1983 года Муллис придумал процесс полимеразной цепной реакции. Справа внизу: хайвей 128 в районе Мендосино — здесь по пути на дачу Муллис испытал историческое озарение. В эти два дня было выпито ведро. После чего Муллис благополучно довёл машину до города и бросился в библиотеку смотреть, не приходила ли кому-нибудь в голову его простенькая идея.
Оказалось, нет. Сделал сообщение на производственном семинаре. Каждый пытался объяснить, почему это не сработает, никто не желал помогать. И так аврал, своих задач у всех полно. А друг советовал: «Не надо. Они же не хотят. Не оставляй записей. Уволься, пережди годик, тогда сделай реакцию и патентуй.
Заработаешь миллионов триста! В 1943 году, работая на «Сандоз», он случайно получил ЛСД и засветил её в лабораторном журнале, фактически подарив своей фирме. А лет через 20 до Хофмана дошло, какие деньги прошли мимо него. Муллис отвечал им, что ему нравится «Ситес», и если полимеразная цепная реакция принесёт доход, работодатель его не обидит. Ах, как он потом смеялся над этой своей глупостью! В полночь 9 сентября 1983 года Кэри заложил смесь ДНК с полимеразой в пробирку, нагрев которой контролировал компьютер. За 36 часов ничего не произошло. Он копировал слишком длинный ген слишком слабой полимеразой.
Довести ПЦР до ума удалось только к 1985 году. Муллис направил статью о своём изобретении в Nature. Не приняли, показалось неинтересно. Статья прошла в Science, и то со скрипом, не с первого захода что не помешало тому же редактору Science в 1989-м объявить полимеразу «молекулой года». Корпорация «Ситэс» продала технологию ПЦР за 330 миллионов долларов, уволила Кэри Муллиса с начислением ему 5 месячных зарплат и облегчённо вздохнула. Никто больше не скандалил с начальством, не донимал сотрудниц харрасментом, не тащил коллег из совещательной комнаты в коридорчик на «мужской разговор», и не угрожал оружием вахтёру, который пускает на работу только с бэджиком. ПЦР очень скоро оценили врачи. Она обнаруживает любой патоген, если в пробе найдётся хоть одна бактерия или частица вируса.
Даже задолго до того, как этот враг размножится и вызовет болезнь. Ничего подобного медицина прежде не знала. Технология пришлась кстати в условиях всеобщей паники по поводу недавно открытого СПИДа. Муллис и тут занял особую воинственную позицию. Он утверждал, что иммунодефицит вызывается не только вирусом, который назвали ВИЧ, но и рядом других ретровирусов. Эта теория не получила признания и Кэри прослыл парией.
Опять температура повышается до 93 - 95 градусов, цепочки разъединяются... Обычно за 1 - 2 часа при наличии вирусной ДНК ее становится столько, что не заметить ее, даже при стандартном методе обнаружения становится просто нереально. Схематично, это выглядит так: Подведём итог: каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию денатурация происходит так называемое раскручивание ДНК — то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК.
Во вторую отжиг - происходит присоединение праймера к участку нити ДНК. И, наконец, в заключительной третьей стадии, "фермент-строитель" достраивает нити, восстанавливая ДНК. В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения амплификаций определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни тысяч или миллионы копий. Поначалу для каждой стадии использовали отдельную водяную баню, что сильно увеличивало время получения результата. Поставить "на поток" метод помогли специальные автоматические термостаты - амплификаторы, в которых изменение температуры происходит по заданной программе. Современный амплификатор — сложный электронный прибор, не только управляющий циклами амплификации и поддерживающий необходимые температуры, но и делающий количественные замеры после каждого цикла. В её основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки. Для этого в состав реакционной смеси, наряду с праймерами и другими компонентами реакции, добавлены специальные флуоресцентные метки зонды.
Флуоресцентный зонд выполнен по той же технологии, что и праймер и отличается он него тем, что на одном его конце прикреплена флуоресцентная молекула флуорофор , а на другом конце расположена специальная молекула-гаситель флуоресценции. За счёт близости гасителя, энергия поглощаемая флуорофором не вызывает флуоресцентного свечения, а целиком передаётся гасителю. При этом, при облучении смеси ультрафиолетом, флуоресцентный отклик полностью отсутствует. Дальше всё происходит, так же, как было описано выше: В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК с распадом на две половинки. Зонд вместе с праймерами присоединяется к комплементарному участку ДНК. При этом флуорофор и гаситель освобождаются, расстояние между ними увеличивается и эффект гашения перестаёт работать. Теперь при облучении смеси ультрафиолетом, мы получим устойчивый флуоресцентный сигнал-отклик от флуорофора. Изготавливая молекулы флуорофора с разным цветом свечения можно проводить одновременный поиск разных возбудителей в одной пробирке. Большинство используемых сегодня, для ПЦР диагностики, амплификаторов , относится к классу автоматических, высокоскоростных многофункциональных Real Time аппаратов. Они позволяют проводить множественный ПЦР анализ до 5 мишеней цветных флуоресцентных красителей в 96 пробирках одновременно.
Итак, каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию происходит так называемое раскручивание ДНК — то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую - происходит присоединение «затравки» к участку нити ДНК. И, наконец, удлинение данных нитей ДНК, которое производится ферментом-«строителем».
В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи. Этапы проведения ПЦР исследования Забор биологического материала для исследования В качестве пробы служит различный биологический материал: кровь и ее компоненты, моча, слюна, отделяемое слизистых оболочек, спинномозговая жидкость, отделяемое раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Все биопробы собираются одноразовыми инструментами, а набранный материал заключают в пластиковые стерильные пробирки или помещают на культуральные среды, с последующей транспортировкой в лабораторию.
В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат — термоциклер амплификатор. В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов денатурация, отжиг и удлинение. Что это означает? Рассмотрим подробнее.
ПЦР: современные методики диагностики туберкулеза
Обычно постановка и учет результатов занимает несколько дней. При этом в заключении будет лишь указано, выявлен возбудитель или нет. Определить стадию и наличие антител, которые свидетельствуют о том, что человек уже переболел COVID-19, уточнить не удастся. Основные проблемы, с которыми сталкиваются врачи на этом этапе — достоверность анализа, возможность получения ложноотрицательных результатов. Развитие технологии идет по пути повышения чувствительности исследования, минимальной концентрации РНК вируса в исследуемом образце, которую способна обнаружить тест-система. По мнению специалистов, причина ложноотрицательных результатов может быть и в некорректном заборе материала для исследования. Именно поэтому результат теста имеет диагностическую значимость в совокупности с другими данными, клиническими признаками, эпидемиологическим анамнезом, результатами рентгенологической диагностики или компьютерной томографии. Если при отрицательном результате подозрение на коронавирусную инфекцию сохраняются, на приеме терапевта — врач назначает повторное обследование. ПЦР-диагностика рекомендована таким категориям населения: людям, имеющим симптомы COVID-19, длительное время повышенную температуру, сухой кашель и пр.
Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя. Преимущества метода ПЦР Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Исключен риск ложноположительных результатов. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена или даже уже неактивных — разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве , чтобы он был обнаружен в ходе исследования. Скорость проведения. Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент — уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны. Диагностика латентных инфекций. ПЦР-диагностика определяет возбудителя инфекции даже в инкубационном периоде и при скрытом течении заболевания. Какие есть недостатки Единственный серьезный недостаток, связанный с методом полимеразной цепной реакции, - его высокая технологичность. Исследования ПЦР требуют строжайших соблюдений правил и серьезной оснащенности лабораторного комплекса. Не каждая лаборатория может позволить себе все необходимое оборудование. Урогинекология диагностика инфекций, передающихся половым путем: хламидиоз, уреаплазма, микоплазма, кандиды, гарднерелла, герпесвирусы.
ПЦР получила широкое распространение в различных областях практической медицины. Исследование является одним из основных методов диагностики различных инфекционных заболеваний с половым путем передачи. К ним относятся патологические процессы, вызванные: вирусами герпетическая, папилломавирусная инфекция , ВИЧ СПИД, вирусные гепатиты с парентеральным путем передачи специфическими бактериями сифилис, гонорея, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз простейшими трихомониаз Полимеразная цепная реакция также может использоваться для диагностики инфекций, вызванных условно-патогенными грибами кандидоз. Какой материал исследуется? Материалом, который используется для лабораторного исследования методом ПЦР, являются различные биологические жидкости организма человека.
Ее можно сравнить с отпечатком пальца или сканом сетчатки глаза человека. Укороченные последовательности нуклеотидов, характерные для каждого вида патогена возбудителя опасных заболеваний , хранятся в базах научных лабораторий в виде праймеров — отдельных участков ДНК, типичных для только конкретного возбудителя. Эти участки значительно короче любой молекулы ДНК. Такие праймеры присоединяются к ДНК возбудителя в пробе и под действием катализаторов многократно воспроизводят свои дубли. Этот процесс называются «репликация» — многократное увеличение, дублирование искомого участка до тех пор, пока он не станет доступен для определения. Процесс репликации возможен только при наличии в пробе ДНК возбудителя. Преимущества метода ПЦР Высокая специфичность. Метод ПЦР определяет заданную последовательность нуклеотидов, присущую конкретному патогену. Исключен риск ложноположительных результатов. Для ПЦР достаточно всего несколько молекул ДНК патогена или даже уже неактивных — разрушенных вирусных частиц, сохранивших специфические участки ДНК в достаточном количестве , чтобы он был обнаружен в ходе исследования. Скорость проведения. Лаборатория получает результат ПЦР-теста через несколько часов, клиент — уже на следующий день. Скорость диагностики имеет принципиально важное значение для своевременного лечения. Например, при диагностике бактериальных инфекций классический посев занимает от нескольких дней, а с ПЦР-анализом пациент сможет принять меры и начать лечение уже через сутки. Для исследования подходит любой биоматериал: кровь, моча, сперма, мокрота, гной, жидкости из абсцессов и пр. Кроме этого, ПЦР применяется в самых разных областях науки и медицины, работая даже там, где другие методы бессильны. Диагностика латентных инфекций.
Когда назначается ПЦР-диагностика?
- Похожие статьи
- ПЦР: сверхчувствительная диагностика инфекций
- Диагностика COVID-19: обзор основных методов
- Что такое ПЦР анализ
Из плюсов:
- «Вероятность обнаружить вирус снижается». Когда нужно сдавать ПЦР-тест
- Читайте также
- Что такое ПЦР?
- ПЦР: метод тестирования, который слишком недооценен | MedAboutMe
Капельная цифровая ПЦР (ddPCR)
Полимеразная цепная реакция: принцип работы. Несмотря на революционное значение, принцип ПЦР основан на довольно базовых свойствах молекулы ДНК. ПЦР-тест. Полимеразная цепная реакция – что это такое, какие заболевания выявляет, в чем преимущества и недостатки анализа и что значат его результаты – в материале РИА Новости. ПЦР – полимеразная цепная реакция. Полимеразная цепная реакция. Разобравшись, чем отличается тест ПЦР от антител на КОВИД, удастся облегчить диагностику коронавирусной инфекции, избежать лишних финансовых трат на несвоевременные или недостоверные обследования.
Вы точно человек?
Превосходные свойства уплотнительного ободка позволяют проводить реакции ПЦР в объеме до 5 мкл. Принцип полимеразной цепной реакции Слева: упрощённая схема удвоения ограниченного праймерами фрагмента молекулы ДНК в процессе ПЦР, с диапазонами рабочих температур каждой стадии. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) описывается как метод многократного "увеличения" (копирования) определенных последовательностей ДНК с помощью фермента ПЦР и искусственных нуклеотидов. Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, а также автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Иностранные граждане обязаны предъявить отрицательный результат ПЦР-тестирования, проведённого не ранее чем за два дня до прибытия на территорию Российской Федерации.