Согласно внесенным изменениям в санитарные правила, при контакте с зараженным коронавирусной инфекцией тест на COVID-19 методом ПЦР следует делать только при появлении симптомов. medium ПЦР (Полимеразная цепная реакция) Если попытаться описать ПЦР-диагностику в трёх словах, то это, совершенно определённо, будут слова ТОЧНО, НАДЁЖНО, БЫСТРО. Диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) показывает наличие половых инфекций с очень большой точностью.
ПЦР-тестирование: как работает метод ПЦР в диагностике
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — высокоточный метод диагностики заболеваний, основанный на копировании ДНК или РНК патогена в пробе. В середине 1990-х с помощью метода ПЦР-амплификации ДНК исследовали останки царской семьи Романовых. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладает высокой специфичностью при выявлении РНК SARS-CoV-2. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Этот метод используется во всем мире при разработке тест-систем на основе ОТ-ПЦР, в том числе для диагностики РНК-содержащих вирусов, к коим относится и новый коронавирус SARS-CoV-2.
Что такое анализ ПЦР?
Если в пробе РНК коронавируса его не обнаружили, то это означает, что на момент взятия мазка пациент не инфицирован. Метод ПЦР отличается более высокой чувствительностью, чем экспресс-тест, и информативен для выявления всех известных штаммов коронавируса, включая «омикрон». В редких случаях пациенты с симптомами COVID-19 или его бессимптомные носители могут получить отрицательный результат теста. Это возможно при низкой вирусной нагрузке слишком малое количество вируса в верхних дыхательных путях , поздних стадиях заболевания, когда у пациента уже поражены лёгкие вирус «спустился» из носоглотки в лёгкие , и при неправильном взятии мазка. Такое бывает, когда мазок берут со слизистой носовых ходов и ротовой полости, а не из носоглотки и ротоглотки.
Тем не менее почти половина! Конечно, ранее в условиях внезапной пандемии и нехватки времени, это можно было оправдать. Однако теперь, спустя месяцы, появились современные тест-системы с РНК в качестве ВКО и, естественно, предпочтительнее использовать их. Некоторые разработчики пошли еще дальше. Пастера приложили все усилия, чтобы разработать тест-систему по всем правилам и мировым стандартам ПЦР-диагностики. Фаг, в свою очередь, защищает РНК от разрушения при взаимодействии с клиническим образцом, тем самым получается препарат армированной защищенной РНК коронавирусной инфекции. Попросите инструкцию, прочитайте, не все так сложно.
В настоящее время это золотой стандарт диагностики коронавируса. Прежде всего, это высокая чувствительность, т. Во-вторых, тест также высокоспецифичный точный , то есть сводит к минимуму риск ложноположительных результатов правильно определяет здоровых людей.
Еще одно преимущество метода - скорость и повторяемость. Стоит помнить, что возможность тестирования с помощью этого метода сейчас широко доступна. Сделать тест на коронавирус вы можете в нашей лаборатории.
Бактериологический метод бакпосев Бакпосев — метод диагностики ЗППП путем выращивания микробов в благоприятной для этого среде. Он является золотым стандартом в определении инфекций, поскольку выявляет не только вирус, но и его активность. Преимуществом данного метода является возможность не только выявить бактерию, но и возможность получить антибиотикограмму, на основе которой врач назначает точное лечение. Наиболее часто бакпосев используют для диагностики уреаплазмоза, микопламзоза, трихомониаза, хламидиоза, различных форм кандидоза. Правила сдачи анализа на бакпосев: за сутки не спринцеваться, не пользоваться вагинальными свечами; за сутки до анализа воздержаться от половых контактов; за неделю прекратить прием антибиотиков; не опорожнять мочевой пузырь за 1,5-2 часа.
Молекулярная диагностика ПЦР ПЦР-диагностика, или полимеразная цепная реакция, направлена на определение специфической нуклеотидной последовательности участка ДНК возбудителя инфекции внутри клетки, чего нельзя добиться при мазке или бакпосеве. ПЦР-анализ часто используется для выявления: хламидиоза, уреаплазмоза, микоплазмоза, гениального герпеса, гонореи, трихомониаза. Данный метод способен выявить возбудителя даже на стадии инкубационного периода, однако он не дает представления об активности вируса, как это дает ИФА.
ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится?
Если вы сомневаетесь, можно ли вам сдавать ПЦР или нет, проконсультируйтесь с врачом. Разберем, какие материалы могут быть применены для тестирования ПЦР. Тем не менее, существует определенный перечень материалов, которые покажут наиболее точные результаты. Соскобы со слизистых оболочек чаще всего уретры, влагалища, шейки матки. Их исследуют, главным образом, для диагностики половых инфекций. Таким способом во взятом мазке можно обнаружить возбудителей уреаплазменной и микоплазменной инфекций, гонококки, хламидии, трихомонады, гарднереллы, грибки рода Candida, вирус генитального герпеса и др. Ее можно использовать в диагностике урогенитальных инфекций. ПЦР анализ мочи является альтернативой исследованию мазка из уретры для мужчин. Это особенно подходит тем пациентам, которые боятся болезненного взятия уретрального мазка. Бронхиальная слизь.
Может исследоваться с целью диагностики респираторных форм хламидийной и микоплазменной инфекций. Анализ крови ПЦР — это один из самых точных способов выявления в организме некоторых патогенных вирусов.
ПЦР с «горячим» стартом дает возможность минимизировать вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР и возможность получения ложноположительных результатов анализа. ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» End-point PCR — эта модификация позволяет учитывать результаты реакции по наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирку. Таким образом, решается проблема контаминации ампликонами. Преимущество состоит в возможности совмещения детекции и количественного определения специфической последовательности ДНК в образце после каждого цикла амплификации в реальном времени. Для этого используются флуоресцентные красители, которые интеркалируют в двуцепочечные молекулы ДНК или модифицированные дезоксинуклеоты, флуоресцирующие после гибридизации с комплементарными участками ДНК. Мультиплексная мультипраймерная ПЦР — амплификация двух и более последовательностей ДНК в одной пробирке одновременно. Преимущество этого метода заключается в возможности выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или генотипирования множественных аллелей и т. Все перечисленные виды ПЦР не могут быть проведены без необходимого пространства и оборудования.
Комплект необходимого оборудования для проведения ПЦР должен включать в себя все необходимые приборы для выделения НК, их амплификации и детекции результатов. Все оборудование должно быть исправным, иметь технический паспорт и инструкцию по эксплуатации. Все приборы должны соответствовать нормам безопасности. Для предотвращения контаминации исходных образцов используют одноразовые пробирки с плотно закрывающимися крышками и наконечники к микродозаторам, термостаты с твердотельнымтермоблоком, специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок. Смена наконечников является обязательной после каждой проведенной манипуляции [3]. Для каждого отдельного помещения предусмотрено наличие холодильников и морозильников для поддержания определенной температуры, вортексов и ротаторов для перемешивания, центрифуг различной мощности для перемешивания и разделения образцов. Также необходимо наличие комплекта дозаторов различного диапазона объемов и подходящих для них наконечников, штативов для микропробирок, самих микропробирок центрифужных, градуированных и пр. Все комнаты должны быть оснащены бактерицидными рецикуляторами для дезинфекции воздуха при помощи УФ, все рабочие поверхности и наружные поверхности корпусов приборов должны быть устойчивы к дезинфекции. Помимо перечисленного списка каждая зона лаборатории должны содержать конкретный набор приборов, необходимых для выполнения соответствующих задач. Организация зон лаборатории представлена на схеме [4].
Зона приема, регистрации и первичной обработки материала должна быть оборудована центрифугами для осаждения и разделения компонентов проб. Обозначения: 1 — зона приема, разбора и первичной обработки материала; 2 — зона подготовки проб и выделения НК; 3 — зона приготовления реакционных смесей, проведения ОТ и ПЦР; 4 — зона детекции результатов методом электрофореза и ГиФА; 5 — комната анализа результатов; 7 — комната обеззараживания материала. В последней, но немаловажной зоне дезинфекции материалов необходим паровой стерилизатор для обработки образцов водяным паром под давлением. Состав оборудования может варьировать в зависимости от размера лаборатории и других факторов. Заключение Метод ПЦР находит применение в различных областях диагностики. Его применяют для выявления в клинических образцах вирусов, бактерий, простейших, а также для обнаружения приобретенных и врожденных генетических нарушений и идентификации личности [5]. Автоматизация этапов денатурации, отжига и элонгации с применением современного оборудования позволяет упростить проведение анализа и способствует его широкому применению в различных областях диагностики. Однако повсеместное внедрение данного метода ограничивается необходимостью ручной и трудоемкой подготовки проб идетекции результатов, а также необходимостью в оснащенной лаборатории со всеми необходимыми реактивами и оборудованием. Сфера применения полимеразной цепной реакции в дальнейшем будет расширяться, так как все чаще в клинической практике имеют дело с очень небольшим количеством исследуемого материала, анализ которого возможен только этим методом. Появление все новых видов ПЦР способствует охвату большего спектра возможностей для применения метода, упрощает и ускоряет его проведение, тем самым позволяя получить наиболее точный, верный и быстрый результат.
Но для каждого микроорганизма реактив нужен свой, так что универсальных тестов ПЦР на все инфекции сразу не бывает. Подготовка к анализу зависит от того, какой биологический материал вы сдаете. Если кровь, то особо готовиться не надо. Для других материалов есть несложные правила — если их соблюдать, анализ будет точнее. Если вам назначили качественный ПЦР-анализ, имеет смысл сдавать его или в государственной лаборатории если обследование положено по ОМС , или в частной, где окажутся подходящие цены.
Поэтому решите для себя заранее, сможете ли вы спокойно жить дальше или будете лечить результаты анализа даже в тех случаях, когда до похода в клинику у вас не было никаких проблем с интимным здоровьем. Иначе обстоят дела с обследованием на ЗППП в группе риска — у людей с рискованным сексуальным поведением и беременных женщин. Им необходимо периодически сдавать анализы на половые инфекции, даже если нет никаких жалоб на здоровье. Сексуальным экстремалам профилактическое обследование нужно, чтобы выявить факт инфицирования еще до появления симптомов и как можно раньше принять меры для защиты своих половых партнеров от заражения. Беременным женщинам диагностика ЗППП необходима, потому что многие мамины инфекции передаются будущему малышу.
Даже если нет симптомов у женщины, последствия для ребенка могут быть тяжелыми. Согласно принятым государственным программам как в нашей стране , так и в США , профилактическая диагностика скрининг на ЗППП проводится только среди людей с рискованным сексуальным поведением и у беременных женщин. Скрининг на герпес и ВПЧ не проводят даже в группе риска. Для остальных людей при отсутствии жалоб и клинических проявлений обследование на ЗППП вообще не рекомендуется. Забор материала — дело нескольких минут. Врач делает это с помощью стерильного зонда в виде ватной палочки, щетки, «ершика» или специальной ложки. Источник: hemltd. По настоящему скрытые инфекции — это редкость. Гораздо чаще встречаются не скрытые, а забытые инфекции: когда вроде что-то было, но само прошло, хотя инфекция никуда не делась, а только перешла в вялотекущую форму. Дело в том, что многие половые инфекции имеют волнообразное течение.
Первые симптомы быстро пропадают без лечения. Затем наступает так называемая «скрытая» стадия: субъективные жалобы отсутствуют, человек считает, что выздоровел, но инфекция медленно развивается, вызывая хроническое воспаление. Спустя какое-то время симптомы болезни обычно возвращаются, только уже вместе с осложнениями. Поэтому любые проблемы в интимной сфере решайте безотлагательно. И еще! Если вы 1-2 раза в год профилактически посещаете профильного врача гинеколога — для женщин, уролога — для мужчин , то вероятность пропустить «скрытую» ЗППП снижается многократно.
Выбор цветовой схемы:
- Актуальные методы диагностики COVID-19
- Запланируйте визит в наш центр
- Полимеразная цепная реакция — Википедия
- Запланируйте визит в наш центр
- Микробиологические исследования
- Улучшение качества обследования пациентов с помощью ПЦР-лаборатории
Микробиологические исследования
Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Кинетическая кривая в координатах "Уровень репортерной флуоресценции - цикл амплификации" имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии: 1. Стадию инициации когда ПЦР-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой. Экспоненциальную стадию в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР. Плато стадию насыщения. По нарастанию интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью программного обеспечения, прилагаемого к амплификатору, вычисляется концентрация исходной матрицы ДНК. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе чувствительность иммунологических и микроскопических тестов - 103-105 клеток.
Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4-4. В настоящее время преимущество ПЦР-анализа перед культуральным методом обнаружения микроорганизмов состоит в следующем:. Эти различия объясняются возможной гибелью микроба при хранении и транспортировке, тогда как ПЦР способна обнаруживать и нежизнеспособные формы микроорганизма. Время, необходимое для обнаружения возбудителя культуральным методом, составляет около 4 суток, тогда как использование ПЦР позволяет обнаружить микроб через 4-5 часов. Использование технологии ПЦР позволяет проводить определение возбудителей, например хламидий, в образцах, взятых неинвазивным путем, например в порциях мочи. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Данный метод сравним по трудоемкости с классическими методами иммуноферментным, иммунофлуоресцентным и т. Поэтому метод ПЦР, наравне с культуральным методом, признается «золотым стандартом» для диагностики инфекционных заболеваний. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Обычно этот интервал составляет 4-8 недель.
Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента и у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, и которые не были протестированы на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа. Последние два пункта важны для разработчиков ПЦР-диагностикумов. В настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя , которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок. Необходим образец генетического материала с места преступления - кровь, слюна, сперма, волосы и т. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически - одной копии. Фрагменты разделяют с помощью электрофореза ДНК. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев. Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны за исключением случая однояйцевых близнецов , родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков.
Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор - фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. В качестве векторов используют, например, плазмиды или вирусную ДНК. Вставку генов в чужеродный организм обычно используют для получения продукта этого гена - РНК или, чаще всего, белка. Таким образом в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др. Это останавливает реакцию, позволяя определить положения специфических нуклеотидов после разделения синтезированных цепочек в геле. Использование ПЦР позволило упростить и ускорить процедуру проведения мутагенеза, а также сделать её более надёжной и воспроизводимой. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний.
Наиболее рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные паразиты и микроорганизмы, способные длительно персистировать в организме хозяина. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения инфекции. Особую диагностическую ценность ПЦР для обнаружения этого вируса представляет по следующим причинам: отсутствие способа культивирования ВГС; 2 наборы для антигенной диагностики не существуют; 3 реакция образования антител к ВГС настолько замедлена, что диагноз во время острой фазы инфекции, как правило, поставить невозможно. Поэтому в настоящее время становится общепризнанным использование технологии ПЦР для диагностики, контроля качества лечения и эпидемиологического анализа заболеваемости, обусловленной ВГС. При этом только технология ПЦР позволяет решать следующие задачи: 1 проводить диагностику острой инфекции при позднем выявлении антител к ВГС; 2 осуществлять этиологическую диагностику хронического гепатита С у иммуносупрессированных пациентов; 3 оценивать эффективность противовирусной терапии; 4 выявлять виремию у доноров крови с нормальным уровнем аминотрансфераз; 5 определять возможную контаминацию препаратов крови; 6 оценивать широту распространения ВГС. Диагностика этих возбудителей традиционными методами микроскопии и бакпосева неэффективна. ПЦР позволяет не только диагностировать хламидиозы и микоплазмозы, но и проводить видовую идентификацию возбудителя С. Использование метода ПЦР позволяет значительно улучшить раннюю диагностику туберкулеза. В настоящее время разработаны и появились на рынке ПЦР-наборы для определения устойчивости микобактерий к антибиотикам.
Наиболее эффективным методом анализа крови на присутствие этих возбудителей является метод ПЦР.
Метод экспресс-диагностики, выявляющий присутствие в биоматериале специфических белков вируса. Выявление вируса через анализ крови. Тест на антитела к коронавирусу. Первые четыре метода имеют идентичную задачу.
Отличаются они сложностью проведения, затрачиваемым временем, точностью. Пятый их заменить не может. Она может делаться только в лабораторных условиях, поскольку требует изучения молекулярной структуры ДНК. Суть процедуры сводится к следующему: Берется мазок из носоглотки человека для большей точности это должен сделать медицинский работник. Выделяется интересующий участок ДНК биоматериала.
Осуществляется амплификация многократное удвоение этого участка до объема, оптимального для визуализации. Изучаются визуализированные фрагменты. Если при копировании участка ДНК в нем продолжает появляться вирус, значит, пациент заражен. Получить результаты ПЦР-теста можно через несколько дней. Во время ожидания особенно при наличии симптомов лучше соблюдать самоизоляцию.
Сегодня это наиболее достоверный диагностический метод. Риск получения ошибочного результата Вероятность получения ложноположительного результата невелика. Вирус может попасть в биоматериал пациента извне при условии нарушения санитарных правил. Поэтому проходить обследование лучше в надежных лабораториях, где подобное исключено. Ложноотрицательные результаты встречаются чаще.
Во избежание их получения перед забором биоматериала нельзя курить и дезинфицировать носоглотку антисептиками. Исказить клиническую картину также могут: ошибки медработника при взятии мазка; забор материала на поздней стадии, когда концентрация вируса минимальна; отсутствие микроорганизмов в носоглотке. Последнее возможно, если коронавируса там не было изначально попал в организм иным путем, например, через кровь.
Еще одно преимущество метода - скорость и повторяемость. Стоит помнить, что возможность тестирования с помощью этого метода сейчас широко доступна. Сделать тест на коронавирус вы можете в нашей лаборатории. Мы также предлагаем сдать анализы крови, мочи и кала для правильной диагностики различных заболеваний. Другие статьи.
Итак, выделение ДНК и РНК - важный шаг подготовки проб для выполнения различных задач в микробиологии, биотехнологии, биохимии, медицинской диагностике и т. Амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т. На сегодняшний день имеется множество специализированных методик, которые могут использоваться для выделения нуклеиновых кислот с высокой степенью очистки. Наиболее известные из них относятся к методикам осаждения НК на суспензионный носитель и выделения НК на колонках. Однако набирают популярность и другие методы, о которых будет сказано позднее. Видео: Выделение ДНК. Просо о сложном. В зависимости от того, из какого организма выделяют НК используют различные методы разрушения клеток: Для разрушения клеток бактерий используют химические вещества, разрушающие клеточную стенку бактерий — ЭДТА, лизоцим, ультразвук, гомогенизация и др. Для лизиса клеток и денатурации белков часто используется детергент додецилсульфат натрия или гуанидинизотиоцианат. Разрушение клеток животных и человека не вызывает сложностей: используют гомогенизацию, обработку SDS додецилсульфатом натрия , либо клетки обрабатывают протеиназами. Для разрушения клеточных стенок растений — ферменты, разрушающие целлюлозу, замораживание в жидком азоте и последующее механическое разрушение клеток и др. Отделение нуклеиновых кислот от белков Депротеинизацию клеточного лизата часто осуществляют с помощью фенола и хлороформа белки переходят в фазу растворителя. Молекулярщики часто подразумевают смесь водонасыщенного фенола с хлороформом 1:1, а не кристаллическое вещество. В смеси с хлороформом фенол работает эффективнее, а изоамиловый спирт гасит пенообразование. Часто белки разрушают протеиназами, например, протеиназой К; центрифугированием для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Ряд современных методов предусматривает осаждение ДНК на гранулах силикагеля, центрифугирование и последующую элюцию ДНК с гранул в раствор. Некоторые коммерческие наборы предусматривают сорбцию ДНК на мембранах или ионообменных сорбентах. Когда нуклеиновые кислоты остаются в водном растворе: ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе. Концентрацию полученной нуклеиновой кислоты, а также наличие примесей белки обычно определяют спектрофотометрически по поглощению на А260 нм. Максимум поглощения белка приходится на 280 нм. Для оценки чистоты препарата ДНК, свободного от РНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, то есть на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов, соответственно. Пять популярных методик выделения нуклеиновых кислот Выделение фенол-хлороформом Рис. Схема протокола выделения фенол-хлороформным методом. Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статье 1967 года, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот. Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси. После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической нижней фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной верхней фазе Рис. Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз. Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками. Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени. Выделение на спин-колонках Рис. Схема протокола выделения на спин-колонках. Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году. Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК. Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё Рис. Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца. Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено. Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты. Выделение на магнитных частицах Рис. Схема протокола выделения на магнитных частицах. Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 3. Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др. К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними. После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют Рис. Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование например, центрифуга. Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике. Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца. Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena, ThermoFisher и другие. Умное выделение Smart Extraction Рис. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena. Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry. Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор. При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества Рис. Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы. Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот. Ферментативное температурно-зависимое выделение Рис. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM. Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот. SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца. Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку. Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами. Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки. Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов. Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения от 7 минут и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов. Разрезание и сшивание ДНК Рестрикция и рестриктазы Разрезание ДНК с помощью рестрикционных эндонуклеаз Одним из первых и важнейших из шагов молекулярной биологии стала возможность разрезать молекулы ДНК, причем в строго определенных местах. Этот метод был изобретен при изучении в 1950—1970-е годы такого феномена: некоторые виды бактерий при добавлении в среду чужеродной ДНК разрушали ее, в то время, как их собственная ДНК оставалась невредимой. Оказалось, что они для этого используют ферменты, позднее названные рестрикционными нуклеазами или рестриктазами. Важным свойством каждого подобного фермента является его способность разрезать строго определенную - целевую - последовательность нуклеотидов ДНК. Рестриктазы не воздействуют на собственную ДНК клетки, поскольку нуклеотиды в целевых последовательностях модифицированы так что, рестриктаза не может с ними работать Правда, иногда, наоборот, они могут разрезать только модифицированные последовательности - для борьбы с теми, кто модифицирует ДНК, защищаясь от вышеописанных рестриктаз. Из-за того, что целевые последовательности бывают различной длины, частота встречаемости их в молекулах ДНК варьирует чем: длиннее необходимый фрагмент, тем меньше вероятность его появления. Соответственно, образующиеся при обработке различными рестриктазами фрагменты ДНК будут иметь различную длину. Рисунок слева. Сайты рестрикции. Сверху — целевая последовательность рестриктазы SmaI, при работе которой образуются «тупые» концы. Снизу — целевая последовательность рестриктазы EcoRI, при работе которой образуются «липкие» концы. Итак, рестриктазы — это группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих гидролиз фосфодиэфирных связей чужеродных ДНК в большинстве прокариотических и некоторых других организмах и выполняющие тем самым «иммунную» функцию — системы рестрикции-модификации. Для исследований их выделяют преимущественно из прокариотических клеток. Данные ферменты, «узнающие» определенные последовательности сайты рестрикции в двухцепочечной ДНК, расщепляют нуклеиновые кислоты в середине молекулы. Рестриктазы этого типа - узнают палиндромальные последовательности, которые обладают центральной осью и считываются одинаково в обе стороны от оси симметрии. Эти рестриктазы узнают асимметричные сайты. Также рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид последовательность из 4-х пар оснований и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Рестрикционный анализ ДНК Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции, которые приводятся в описании, прилагаемом фирмой-изготовителем. Основные переменные параметры — это температура инкубации и состав буфера. К температурному режиму предъявляются достаточно жесткие требования, тогда как различия между буферами чаще всего лишь незначительны. Рестрикционный анализ ДНК широко используется в молекулярно-биологических исследованиях и прикладных работах и является одним из наиболее важных инструментов при изучении ДНК. При помощи эндонуклеаз рестрикции можно исследовать ДНК различных вирусов, бактерий, животных, растений.
Что такое ПЦР анализ
Флуоресцентные методы детектирования продуктов ПЦР расширяют возможности применения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). Подчеркнем, что это исследование не направлено на выявление COVID-19 и не заменяет ПЦР-тест. Методы исследования нуклеиновых. С появлением секвенирования нового поколения метод ПЦР утрачивает клиническую важность при необходимости исследования широкой панели генов. ПЦР (полимеразная цепная реакция) — это метод тестирования, который способен находить генетический материал вируса непосредственно в крови пациента, слюне или любой другой жидкости, изобретенный в 1983 году американским биохимиком Кэрри Муллисом.
Что такое ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важнейший лабораторный метод исследования тонкой молекулярной структуры генетического материала. Для диагностики этих инфекций рекомендуется использовать методы ПЦР-диагностики и ИФА-исследований. производстве и внедрении высокотехнологичного оборудования и реагентов для исследований методом ПЦР. один из наиболее чувствительных и надежных количественных методов анализа экспрессии генов.